結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中缺氧誘導(dǎo)因子1-α與FasL的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，其預(yù)后較差，生存率低，其中結(jié)直腸癌的浸潤轉(zhuǎn)移是術(shù)后復(fù)發(fā)和導(dǎo)致患者死亡的重要原因。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是一個多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程，癌細(xì)胞對腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境的耐受與適應(yīng)是發(fā)生轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄因子缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1alpha，HIF-1α)作為感受不同氧環(huán)境下氧分壓的中樞調(diào)控子，除調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)外，尚能夠調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，積極參與腫瘤的侵襲、

2、轉(zhuǎn)移等病理生理過程。因其作用機制復(fù)雜，目前仍缺乏深入了解。為此，本課題在既往對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移研究的基礎(chǔ)上，探討腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中HIF-1α與FasL的表達(dá)，以期進(jìn)一步了解結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制，為臨床防治提供新的靶點與理論依據(jù)。 方法： 1.采用分子克隆方法，將我室已構(gòu)建的FasL-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒與pcDNA3.1(-)質(zhì)粒進(jìn)行重組，得到新的FasL-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒并進(jìn)行鑒定。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

3、將空質(zhì)粒、FasL-pcDNA3.1(+)與FasL-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人直腸癌HR-8348細(xì)胞，構(gòu)建侵襲力不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞HR-8348L、HR-8348F和HR-8348As并加以鑒定；以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞HR-8348B為空白對照，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測各組細(xì)胞的侵襲能力與增殖速度。 2.采用化學(xué)缺氧法構(gòu)建四組直腸癌HR-8348細(xì)胞缺氧模型，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測各組細(xì)胞缺氧12h后HIF-1α表達(dá)水平，計算陽性表

4、達(dá)百分率；Westernblot方法定量檢測缺氧0h、6h、12h及24h各組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)；并在缺氧12h時相下，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞周期的分布，MTT法測定各組細(xì)胞增殖能力的改變，TUNEL法測定各組細(xì)胞凋亡狀況。 3.采用免疫組織化學(xué)方法，對120例結(jié)直腸癌組織及癌旁組織、30例結(jié)腸腺瘤組織及28例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組織中HIF-1α與FasL，的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并分析HIF-1α表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征和F

5、asL水平之間的關(guān)系。 結(jié)果： 1.新構(gòu)建質(zhì)粒FasL-pcDNA3.1(-)符合要求，F(xiàn)asL酶切片斷及PCR片斷大小正確，測序正確率為99.2％；各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，RT-PCR方法可分別自HR-8348F細(xì)胞和HR-8348AS細(xì)胞中得到FasL和As-FasL片斷；倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞，見HR-8348F細(xì)胞異型性更明顯；單層細(xì)胞體外侵襲實驗見HR-8348F細(xì)胞穿透Transwell濾膜的細(xì)胞數(shù)目為12.930

6、±2.434，顯著多于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As細(xì)胞(分別為8.133±1.959，7.670±2.093和7.870±1.685)(P＜0.05)；HR-8348B、HR-8348L、HR-8348F和HR-8348AS細(xì)胞的群體倍增時間分別為28.3h、41.0h、24h和35.4h。 2.缺氧12h后，HR-8348F細(xì)胞HIF-1α蛋白陽性率為76.0％，顯著高于HR-8348B、HR-834

7、8L和HR-8348As細(xì)胞(分別為48.5％，43.0％和39.5％)(P＜0.05)，而后三組細(xì)胞間無顯著性差異(P＞0.05)。Westernblot檢測示HIF-1α蛋白于120KD處顯色；比較不同缺氧時相各組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)水平，缺氧0h與6h，各組樣品中HIF-1α表達(dá)微量；缺氧12h，HR-8348F細(xì)胞內(nèi)HIF-1α水平較0h和6h時明顯增高(P＜0.05)，而HR-8348B、HR-8348L及HR-8348A

8、s細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)與6h時無明顯變化(P＞0.05)；缺氧24h，HR-8348F細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)仍處于較高水平，但與缺氧12h表達(dá)量比較差別不顯著(P＞0.05)，HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)水平則較缺氧12h略有下降，但不具備統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；組間比較，缺氧0h、6h時各組細(xì)胞HIF-1α蛋白水平無顯著性差異(P＞0.05)，缺氧12h、24hHR-8348F細(xì)胞

9、HIF-1α水平顯著高于HR-8348B、HR-8348L及HR-8348As細(xì)胞(P＜0.01)。測定缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞生物學(xué)特性，見HR-8348F細(xì)胞的增殖指數(shù)(60.43±3.61)顯著高于HR-8348B、HR-8348L和HR-8348As細(xì)胞(40.01±3.22，41.30±3.96和35.87±4.28)(P＜0.05)，增殖抑制率和凋亡指數(shù)(17.30±2.08和13.10±1.06)顯著低于HR-8348B、HR-8

10、348L、HR-8348As細(xì)胞(33.70±4.56和21.60±1.33，34.20±4.12和20.10±1.17，38.00±4.79和23.90±1.25)(P＜0.05)。 3.HIF-1α陽性率在結(jié)直腸癌旁粘膜中為5.8％(7/120)，在結(jié)腸腺瘤組織中為20.0％(6/30)，在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中分別為71.7％(86/120)和89.3％(25/28)；癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中HIF-1α的表達(dá)水平顯著高于腺

11、瘤和癌旁組織(P＜0.01)，腺瘤組織中HIF-1α水平亦高于癌旁粘膜組織(P＜0.05)，而癌原發(fā)灶與肝轉(zhuǎn)移灶中HIF-1α水平無明顯差異(P＞0.05)。FasL的陽性表達(dá)率在癌旁粘膜、結(jié)腸腺瘤、癌原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中分別為15.0％(18/120)、23.3％(7/30)、69.2％(83/120)和100.0％(28/28)；癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中FasL的表達(dá)水平明顯高于腺瘤和癌旁組織(P＜0.01)，而腺瘤和癌旁組織中、癌原發(fā)灶與

12、肝轉(zhuǎn)移灶中FasL水平均無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)直腸癌原發(fā)灶中HIF-1α的表達(dá)水平與患者性別、年齡、病理組織學(xué)類型及分化程度無關(guān)(P＞0.05)，而與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況及Dukes分期密切相關(guān)(P＜0.05)。發(fā)生肝轉(zhuǎn)移患者的癌原發(fā)灶中HIF-1α和FasL陽性表達(dá)率分別為92.9％(26/28)和85.7％(24/28)，與無肝轉(zhuǎn)移組(分別為65.2％，60/92和64.1％，59/92)相比均差異顯著(P＜0.01)；HI

13、F-1α與FasL的表達(dá)強度有等級相關(guān)性(r=0.924，JP＜0.01)。 結(jié)論： 1.應(yīng)用分子克隆技術(shù)將正義FasL片斷轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)可構(gòu)建具有高侵襲力的細(xì)胞，結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)FasL的表達(dá)強度與其侵襲能力呈正相關(guān)； 2.結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)FasL表達(dá)增強可促進(jìn)缺氧狀態(tài)下細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增高，促進(jìn)細(xì)胞對微環(huán)境缺氧的適應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖加速，凋亡減少，侵襲能力進(jìn)一步增強； 3.結(jié)直腸癌組織中HIF-