Annexin a2參與耐藥乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　膜聯(lián)蛋白a2(Annexina2，Anxa2)是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，在侵襲性腫瘤中表達(dá)明顯增高。前期研究結(jié)果提示與親本細(xì)胞相比，有多藥耐藥表型的乳腺癌細(xì)胞的遷移能力明顯提高，Anxa2可能是一個(gè)與腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移雙重表型相關(guān)的重要分子。本研究通過提高乳腺癌細(xì)胞中Annexina2的表達(dá)和降低耐藥乳腺癌細(xì)胞中Annexina2的表達(dá)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，觀察Annexina2的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影

2、響，并進(jìn)一步探索Annexina2參與調(diào)節(jié)耐藥乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用基因克隆技術(shù)增高人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Annexina2蛋白的表達(dá)水平；RNA干擾技術(shù)降低其多藥耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞中Annexina2蛋白的表達(dá)水平，并分別用Westernblotting技術(shù)對蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。
　　2.低劑量(0.01μM)阿霉素作用MCF-7細(xì)胞，觀察其Annexina2表達(dá)量的變化

3、。
　　3.應(yīng)用測定細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)檢測Annexina2的高表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4.應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Annexina2的高表達(dá)對MCF-7細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　5.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexina2高表達(dá)對MCF-7細(xì)胞周期分布的改變。
　　6.應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Annexina2高表達(dá)對MCF-7細(xì)胞的遷移能力的影響。
　　7.采用體外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測Annexina

4、2的高表達(dá)對MCF-7細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力的影響。
　　8.建立動物模型，觀察檢測Annexina2的表達(dá)對耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞在體內(nèi)成瘤速度及成瘤率的變化。
　　9.應(yīng)用Westernblotting技術(shù)檢測A2蛋白表達(dá)量變化對周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響及ERK通路的激活情況，進(jìn)一步明確Annexina2調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建真核細(xì)胞融合表達(dá)載體pc

5、DNA3.1-Anxa2，將該載體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，篩選到三株單克隆細(xì)胞株，與親本細(xì)胞相比，A2的表達(dá)量增高三倍以上；應(yīng)用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞后篩選得到Annexina2蛋白表達(dá)水平下降80％-100％的2株單克隆細(xì)胞。
　　2.Annexina2表達(dá)水平上升后MCF-7細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　3.Annexina2基因高表達(dá)后MCF-7細(xì)胞克隆形成能力顯著提高(P<0.01

6、)。
　　4.Annexina2表達(dá)水平提高導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞的增殖指數(shù)上升，細(xì)胞周期G0/G1期比例下降，G2/M+S期比例顯著提高(P<0.05)。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Annexina2高表達(dá)后乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　6.體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Annexina2高表達(dá)后細(xì)胞的體外侵襲能力顯著提高(P<0.01)。
　　7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Annexina2降表達(dá)后明顯抑制

7、了乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
　　8.Westernblotting技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞中Annexina2高表達(dá)后C-myc、CyclinD1的表達(dá)水平明顯提高，Annexina2基因降表達(dá)后C-myc、CyclinD1的表達(dá)水平顯著下降；并發(fā)現(xiàn)Annexina2有可能通過參與ERK通路的激活過程。
　　結(jié)論：
　　1.Annexina2表達(dá)水平增高后，MCF-7細(xì)胞的增殖能力和克隆形

8、成能力提高，細(xì)胞增殖指數(shù)上升，細(xì)胞周期分布G0/G1期比例下降，G2/M+S期比例顯著升高。Annexina2表達(dá)水平上升后C-myc和CyclinD1的表達(dá)水平增高，表明Annexina2通過影響C-myc和CyclinD1的表達(dá)水平從而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖過程。
　　2.Annexina2基因高表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞的遷移能力顯著提高，體外侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　3.Annexina2基因沉默后MCF-7/ADR細(xì)胞的體