CD151基因促進(jìn)PC3細(xì)胞增殖、遷移及其分子機(jī)制.pdf

1、本研究包括兩部分：
　　 第一部分：突變型pAAV-CD151真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的：構(gòu)建pAAV-CD151-AAA 194-196 突變體，為研究CD151的功能及CD151-整合素a3/a6 復(fù)合體的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：以pAAV-CD151-HA 質(zhì)粒為模板，采用定點(diǎn)突變技術(shù)，通過(guò)重疊PRC 方法構(gòu)建整合素a3/a6 結(jié)合缺陷的AAA 突變體(pAAV-CD151-AAA 194-1

2、96 突變體)，并用三質(zhì)粒鈣磷共轉(zhuǎn)染的方法包裝成重組腺相關(guān)病毒rAAV-CD151-AAA 194-196，斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)病毒滴度，病毒滴度均達(dá)到1011以上。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了pAAV-CD151-AAA 194-196 突變體，斑點(diǎn)雜交法病毒滴度檢測(cè)證實(shí)成功包裝了重組腺相關(guān)病毒。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建pAAV-CD151-AAA 194-196 突變體并包裝成重組腺相關(guān)病毒，為進(jìn)一步研究CD151的

3、功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：CD151基因促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及其機(jī)制
　　 目的：有研究表明CD151在前列腺癌組織中的高表達(dá)與前列腺癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，但其具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建CD151-整合素結(jié)合缺陷突變體，然后分別將CD151基因及整合素結(jié)合缺陷的CD151 突變體基因轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3細(xì)胞，然后觀察PC3細(xì)胞的增殖和遷移能力的變化從而探討CD151-整合素復(fù)合體及C

4、D151對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制。
　　 方法:用FugeneHD分別將質(zhì)粒pAAV-CD151、pAAV-CD151-AAA 194-196(整合素a3/a6 結(jié)合缺陷突變體)、pAAV-GFP和等體積PBS轉(zhuǎn)染入PC3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染入PC3細(xì)胞，72小時(shí)后，將細(xì)胞消化、傳代至六孔板、96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后做Western blot檢測(cè)CD151 蛋白、整合素a3、整合素a6、的表達(dá)和磷酸化ERK和總ERK的表達(dá)(

5、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)。通過(guò)免疫共沉淀方法研究CD151 與整合素a3/a6 形成功能性復(fù)合體的能力。通過(guò)MTT方法研究CD151基因?qū)C3細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)Boyden 趨化小室研究CD151基因?qū)C3細(xì)胞遷移的影響。
　　 結(jié)果：CD151組和CD151-AAA 194-196 突變體組的CD151 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和GFP組明顯增加；CD151組的CD151-整合素a3/a6表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和GFP組；CD1

6、51 突變體組的CD151-整合素a3/a6 復(fù)合體表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組和GFP組。此外，CD151組的PI3K、磷酸化Akt、磷酸化ERK的表達(dá)量明顯高于其它三組(P<0.05)，CD151 突變體組的PI3K、磷酸化Akt、磷酸化ERK的表達(dá)量最低，明顯低于對(duì)照組和GFP組(P<0.05)；CD151組的細(xì)胞增殖能力比對(duì)照組和GFP組明顯增高(相對(duì)吸光值分別為：0.675±0.083vs0.383±0.062和0.413±0.07

7、2)，ERK 抑制劑組和PI3K 抑制劑組的細(xì)胞增值能力與CD151組相比明顯減弱；CD151組的細(xì)胞遷移數(shù)(107.8±9.6)亦顯著高于對(duì)照組和GFP組(53.0±7.6和57.0±5.2，P<0.05)；CD151 突變體組的細(xì)胞增殖和遷移能力最低。
　　 結(jié)論：CD15I在前列腺癌細(xì)胞的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要的作用，是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要分子基礎(chǔ)。其分子機(jī)制為CD151 與整合素a3/a6 形成復(fù)合體促進(jìn)ERK信號(hào)通路、PI3K/