阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp和CHMm體內(nèi)外抑制機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類的健康，并已成為現(xiàn)階段重大的公共醫(yī)療問(wèn)題。探尋有效的治療惡性腫瘤的方法早已成為世界各國(guó)醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。近年來(lái)隨著我國(guó)社會(huì)的發(fā)展，人們的生活方式和所處生態(tài)環(huán)境的改變導(dǎo)致了惡性腫瘤的發(fā)病形勢(shì)極為嚴(yán)峻，造成社會(huì)負(fù)擔(dān)日益加劇，其中乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤性疾病。近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，乳腺癌的發(fā)病率和致死率均有逐年上升的趨勢(shì)。
　　阿司匹林作為經(jīng)典的非甾類抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、防治心腦血管疾病等功效，被廣

2、泛應(yīng)用于臨床各領(lǐng)域。近年來(lái)隨著對(duì)阿司匹林藥理作用研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明其具有抗腫瘤效應(yīng)。服用阿司匹林可降低癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并有效的延長(zhǎng)癌癥患者的生存期和降低其癌癥的復(fù)發(fā)。目前，大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿司匹林可以在體內(nèi)外抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖活性。隨后人們對(duì)阿司匹林發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的具體分子機(jī)制開(kāi)展了大量的科學(xué)探索，然而從現(xiàn)有報(bào)道來(lái)看，阿司匹林的抗腫瘤作用機(jī)制還未得到完全揭示，這是因?yàn)槠渌幚碜饔幂^為復(fù)雜，并可在不同的腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出不同

3、的作用途徑，同時(shí)缺乏系統(tǒng)和完善的在體實(shí)驗(yàn)，這也限制了阿司匹林在腫瘤臨床中的應(yīng)用。相比較結(jié)腸癌等消化道惡性腫瘤來(lái)說(shuō)，阿司匹林對(duì)于乳腺腫瘤作用效果的報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)于其抗癌機(jī)制的研究也缺乏系統(tǒng)的闡述，且在一些問(wèn)題上還存在明顯的爭(zhēng)議。
　　犬乳腺腫瘤為獸醫(yī)臨床上常見(jiàn)的腫瘤性疾病，對(duì)犬的健康造成嚴(yán)重危害，目前臨床上主要采取手術(shù)切除的方法來(lái)對(duì)其進(jìn)行治療。與人類乳腺腫瘤相同，對(duì)于惡性并伴有轉(zhuǎn)移的犬乳腺腫瘤來(lái)說(shuō)，單純的手術(shù)治療效果并不理想，手術(shù)

4、配合系統(tǒng)的輔助治療方案對(duì)于犬乳腺腫瘤顯得尤為必要。由于犬和人類的生活環(huán)境息息相關(guān)，其一直作為醫(yī)學(xué)研究中理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。此外，犬乳腺腫瘤和人乳腺腫瘤無(wú)論是在發(fā)病病因和病程發(fā)生發(fā)展等方面，都具有高度相似性。開(kāi)展犬乳腺腫瘤的研究不僅能為獸醫(yī)臨床探尋犬乳腺腫瘤有效的治療方案，更可以為人醫(yī)臨床提供重要的數(shù)據(jù)參考。
　　基于阿司匹林的前期研究基礎(chǔ)和犬作為乳腺腫瘤研究模型的重要意義，且目前并未見(jiàn)有阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤的研究報(bào)道，本課題開(kāi)展阿

5、司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的抑制作用及其分子機(jī)制的研究，進(jìn)一步揭示阿司匹林的抗腫瘤作用機(jī)制，為下一步在犬乳腺腫瘤模型中評(píng)價(jià)阿司匹林的抗腫瘤作用提供理論依據(jù)，并為阿司匹林能早日應(yīng)用于乳腺腫瘤的臨床治療奠定一定的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)的方法，檢測(cè)不同濃度阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響，并建立了裸鼠犬乳腺腫瘤移植瘤模型，進(jìn)一步觀察阿司匹林在體內(nèi)的抗腫瘤效果。采用AnnexinⅤ-FITC染色法，檢測(cè)阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)

6、胞的凋亡誘導(dǎo)作用，同時(shí)通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞中PARP、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞周期分布的影響，通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Cyclin D1、CDK4、E2F1和p21蛋白的表達(dá)變化，以揭示阿司匹林阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程的機(jī)制。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿司匹林處理犬乳腺腫瘤細(xì)胞后，PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號(hào)通路

7、中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化，并提取核內(nèi)蛋白，進(jìn)一步檢測(cè)阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白水平的影響，同時(shí)通過(guò)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)p-GSK3β和β-catenin蛋白定位及表達(dá)水平的影響，探究阿司匹林抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞遷移力及侵襲力的影響，并結(jié)合westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了阿司匹林處理后的犬乳

8、腺腫瘤中VEGF和E-cadherin蛋白表達(dá)水平的變化，以闡述阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。評(píng)估阿司匹林與順鉑或他莫昔芬的聯(lián)合應(yīng)用效果，以奠定阿司匹林與其聯(lián)合應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:
　　(1)阿司匹林在體外可以抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp和CHMm的增殖活性，并抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp和CHMm的克隆形成，且呈劑量和時(shí)間依賴性;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，阿司匹林抑制了裸鼠犬乳腺腫瘤移植瘤的生長(zhǎng)，表明阿司

9、匹林在體外與體內(nèi)對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞均具有增殖抑制效應(yīng)。
　　(2)通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明，阿司匹林對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp沒(méi)有凋亡誘導(dǎo)作用，且不影響CHMp細(xì)胞內(nèi)PARP、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá);在10mM阿司匹林作用下，犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm可發(fā)生晚期凋亡和壞死，細(xì)胞內(nèi)PARP蛋白被切割，且Bcl-2/Bax的比值發(fā)生顯著性下降，表明高濃度阿司匹林具有誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移型犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMm發(fā)生晚期凋亡和壞死的作用。阿司匹林誘導(dǎo)犬

10、乳腺腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并下調(diào)了Cyclin D1、CDK4、E2F1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，上調(diào)了p21蛋白的表達(dá)水平，表明阿司匹林可通過(guò)誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞周期阻滯發(fā)揮抗腫瘤效果，
　　(3)通過(guò)檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白實(shí)驗(yàn)，阿司匹林通過(guò)下調(diào)犬乳腺腫瘤細(xì)胞中PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路。
　　(4)阿司匹林抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，主要是下調(diào)p-GSK