CUL4B對腫瘤誘導的髓系抑制細胞的調(diào)控作用及其機制.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 Cul4b條件性敲除小鼠的建立與表型分析
　　前期研究結果顯示Cul4b敲除雜合子小鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩是由于胎盤血管發(fā)育異常所致;CUL4B突變的X連鎖精神發(fā)育遲滯綜合征患者表現(xiàn)出單核細胞增多的表型。這些結果使我們有理由相信CUL4B在血管新生和血細胞分化中發(fā)揮重要作用。為驗證這一假設，本部分首先建立并分析了內(nèi)皮細胞和造血祖細胞特異性敲除Cul4b基因的Tek-Cre條件性敲除小鼠。

2、
　　1.建立Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-條件性敲除小鼠模型:Tek-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠CRE酶的表達受Tek基因啟動子和增強子調(diào)控，Tek基因在內(nèi)皮細胞和造血祖細胞中表達。為獲得組織特異性敲除小鼠，我們將實驗室前期構建的Cul4bflox/flox基因打靶小鼠與Tek-Cre+/-轉(zhuǎn)基因鼠交配，獲得Cul4bflox/Y Te k-Cre+/-條件性敲除小鼠(Cul4bCKO);分別利用免疫組化、Western B

3、lot和實時定量RT-PCR方法證實Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-敲除小鼠的內(nèi)皮細胞和造血細胞中CUL4B得到有效敲除。
　　2.Cul4bflox/YTek-Cre+/-小鼠的表型:對Cul4b CKO小鼠和野生對照小鼠的主要組織進行H&E染色，結果顯示Cul4b CKO小鼠沒有明顯的組織學異常;外周血有核細胞進行計數(shù)分析未發(fā)現(xiàn)白細胞主要亞群在兩種基因型小鼠間的明顯差異，而流式檢測結果顯示Cul4b CKO小鼠外周

4、血、脾臟以及骨髓中都有CD11b+Gr-1+細胞群的累積，未發(fā)現(xiàn)其它成熟的細胞亞群比例的明顯變化，分析這群細胞對T細胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)這群細胞獲得了免疫抑制能力。
　　第二部分 宿主造血系統(tǒng)CUL4B缺失促進腫瘤生長并伴隨MDSCs累積與活化
　　1.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進移植瘤生長:向Cul4b CKO小鼠及其對照小鼠皮下接種B16/F0與EL4移植瘤，結果顯示CUL4B缺失導致腫瘤細胞在Cul4bflox/Y Tek

5、-Cre+/-小鼠體內(nèi)更為迅速地生長。
　　2.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進MDSCs的累積:流式細胞術檢測兩組荷瘤小鼠外周血、脾臟、骨髓以及腫瘤組織中MDSCs的比例，結果顯示MDSCs細胞群在Cul4b CKO小鼠體內(nèi)的累積明顯多于野生對照小鼠，并且這種累積現(xiàn)象在MDSCs的兩個亞群中都存在;為了排除Cul4b CKO小鼠體內(nèi)MDSCs累積的增多是腫瘤生長更速度快帶來的效應，在荷瘤6天時進行上述組織的流式檢測，結果顯示在這個腫

6、瘤生長沒有差異的時間點，MDSCs細胞群在兩種基因型小鼠中的累積已經(jīng)存在顯著差異，證實了CUL4B對MDSCs累積的負調(diào)控作用。
　　3.CUL4B缺失的MDSCs介導了Cul4b CKO小鼠體內(nèi)腫瘤更快的生長:采用MDSC/EL4腫瘤細胞混合移植的模型以及骨髓移植模型檢測了CUL4B缺失導致的移植瘤生長速度加快是否是MDSCs介導的，結果顯示混合CUL4B缺失MDSCs的腫瘤細胞在野生型小鼠體內(nèi)生長更為迅速;移植了CUL4B缺失

7、MDSCs的受體小鼠體內(nèi)腫瘤生長更快并伴隨受體小鼠自體MDSCs更快的累積。
　　4.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失促進機體的免疫耐受:有報道稱MDSCs在抑制機體免疫反應的同時可以抑制機體的免疫排斥反應，促進機體產(chǎn)生免疫耐受。為了檢測Cul4b基因敲除是否改變機體的免疫耐受能力，利用BaBL/c小鼠來源的乳腺癌細胞系4T1對兩種基因型小鼠進行皮下接種，結果顯示CUL4B缺失的小鼠可以耐受4T1腫瘤細胞生長，而野生對照小鼠完全排斥了異源

8、腫瘤的生長。
　　5.造血系統(tǒng)中CUL4B缺失增強MDSCs的免疫抑制能力:MDSCs的免疫抑制功能主要表現(xiàn)在對T細胞功能的抑制，對MDSCs免疫抑制能力的檢測結果顯示:在體外共培養(yǎng)實驗中，CUL4B缺失的MDSCs兩個亞群對CD4+或CD8+T細胞的增殖都有更明顯的抑制作用。在荷瘤小鼠體內(nèi)，Cul4b CKO小鼠腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD4+和CD8+T細胞比例都明顯低于野生型，與此一致的是，CUL4B缺失后荷瘤小鼠外周血以及脾臟中T

9、細胞兩個亞群的比例也都顯著降低;同時，CUL4B缺失后MDSCs胞內(nèi)發(fā)揮抑制作用的效應分子的表達水平普遍有所升高，對應的效應產(chǎn)物ROS以及NO的釋放也明顯增多，證實CUL4B對MDSCs活化的負調(diào)控作用。
　　6.CUL4B缺失導致MDSCs分化異常:為了探究CUL4B缺失導致MDSCs累積加快的原因，對MDSCs的增殖和凋亡情況進行了檢測，結果并未發(fā)現(xiàn)MDSCs的增殖與凋亡在兩種基因型間存在差異;接下來，檢測了CUL4B缺失后造

10、血祖細胞向MDSCs分化的能力，流式檢測結果顯示CUL4B缺失的造血祖細胞分化為MDSCs的比例明顯增多;腫瘤誘導的MDSCs累積常常歸因于其成熟分化的受阻，所以進一步對分離純化的MDSCs進行體外誘導培養(yǎng)，流式檢測結果顯示CUL4B缺失的MDSCs向成熟的巨噬細胞以及樹突細胞分化的能力明顯減弱。綜合看來，CUL4B的缺失通過促進造血祖細胞向MDSCs的分化以及阻礙MDSCs的成熟分化兩方面機制造成了MDSCs的累積。
　　第三部

11、分 CUL4B通過正向調(diào)控AKT/β-catenin信號通路抑制MDSCs的累積與活化
　　1.CUL4B通過調(diào)控GSK3β介導的β-catenin降解抑制MDSCs的累積:有報道顯示β-catenin在MDSCs的累積與免疫抑制功能中發(fā)揮重要作用。為探究CUL4B調(diào)控MDSCs的累積和活化過程是否依賴β-catenin，對β-catenin的蛋白水平進行了檢測，結果顯示CUL4B缺失后MDSCs胞內(nèi)伴隨著GSK3β活性升高β-e

12、atenin的降解增多，從而導致β-catenin蛋白水平下降，而且這一降解增多的現(xiàn)象可以被GSK3β的抑制劑拯救;利用GSK3β的抑制劑分別對分離純化后的Lin-造血祖細胞和MDSCs進行體外誘導處理，流式檢測結果顯示CUL4B缺失所導致的造血祖細胞向MDSCs分化增多以及MDSCs進一步成熟分化受阻的現(xiàn)象都有所改善;利用β-catenin持續(xù)表達的慢病毒分別感染分離純化后的Lin-造血祖細胞和MDSCs后進行誘導分化實驗，也得到了相

13、同的結果;在體內(nèi)，給小鼠腹腔注射LiCl后，Cul4b CKO小鼠外周血中CD11b+Gr-1+細胞群的累積明顯緩解，同時再對小鼠進行荷瘤實驗，CUL4B缺失所引起的腫瘤生長加快的現(xiàn)象也得到明顯拯救。因此，我們得出結論CUL4B通過上調(diào)β-catenin的表達負向調(diào)控MDSCs的累積與活化過程。
　　2.CRL4B協(xié)同PRC2和HDACs轉(zhuǎn)錄抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表達從而促進AKT激酶的活性:為了進一步探究CUL4

14、B調(diào)控GSK3β活性的機制，對野生以及敲除小鼠來源的MDSCs中p-GSK3β(Ser9)的激酶AKT的活性進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)代表AKT活性的Thr308和Ser473兩個位點的磷酸化水平在CUL4B缺失之后都有不同程度地降低，進一步研究發(fā)現(xiàn)這兩個位點磷酸化水平的降低是它們對應的磷酸酶PP2A以及PHLPP1/2表達水平的升高引起的。通過ChIP實驗，證實CRL4B、PRC2和HDACs復合物的主要成分共同結合于PP2A以及PHLPP

15、1/2對應基因的啟動子區(qū)域，q-ChiP結果顯示在CUL4B低表達的RAW264.7細胞中H2AK119的單泛素化水平明顯降低，PRC2的主要組分EZH2和HDACs在這幾個磷酸酶基因啟動子上的結合也明顯減少，同時伴有它們的底物H3K27三甲基化水平的降低以及組蛋白的乙?；降拿黠@升高，說明CUL4B對這些磷酸酶基因具有明顯的轉(zhuǎn)錄抑制作用。
　　3.MDSCs的累積和活化與CUL4B/AKT/β-catenin信號通路呈負相關性

16、:上述實驗顯示CUL4B缺失后引起的MDSCs中AKT/β-catennin信號通路的下調(diào)并且導致MDSCs的累積與活化，那么這種負調(diào)控關系在野生型MDSCs中是否也存在呢？分別在未免疫以及荷瘤小鼠來源的MDSCs中檢測CUL4B、PHLPP1/2、PP2A、AKT、GSK3β以及β-catenin的表達情況，結果顯示在活化的MDSCs中，這些分子的表達水平與CUL4B缺失所導致的信號途徑的改變結果一致，同時伴隨著CUL4B表達的下調(diào)。

17、與此相一致，癌癥患者MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信號也呈現(xiàn)一個顯著低于健康對照的狀態(tài)，表明伴隨著腫瘤進程的發(fā)展，CUL4B/AKT/β-catenin信號通路在MDSCs中表達普遍下調(diào)。
　　綜上，CUL4B可以限制免疫抑制腫瘤微環(huán)境的重要組分MDSCs的累積與活化，因而CUL4B的缺失促進了Cul4b CKO小鼠體內(nèi)移植瘤生長速度的加快以及其機體免疫耐受能力的增強;機制上，CUL4B通過協(xié)同轉(zhuǎn)錄抑制復合物P

18、RC2和HDACs抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表達，進而促進AKT激酶的活性，下調(diào)GSK3β介導的β-catenin蛋白降解，從而負向調(diào)控MDSCs的異常累積;此外，相對比其它造血細胞，健康個體的MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信號途徑的表達下調(diào)，而這下調(diào)一現(xiàn)象在荷瘤小鼠和腫瘤患者中更為顯著。因此，我們得出結論，雖然CUL4B在腫瘤細胞中發(fā)揮原癌基因的作用，但是在免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成中它卻發(fā)揮負調(diào)控因子的