維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ對(duì)髓系造血的調(diào)控及分子機(jī)制研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)，是第一個(gè)用生理性的小分子一一全反式維甲酸誘導(dǎo)分化的白血病。通過分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)所有APL中由染色體易位造成的融合蛋白都保留了維甲酸受體α(RARα)羧基端的大部分。而這種由RARα組成的融合蛋白(x-RARα)降低了對(duì)ATRA的反應(yīng)性，使得它不能被可以激活野生型RARα的生理濃度ATRA活化，只有在藥理劑量的ATRA作用下才能激活并釋放共抑制物、募集共激活物，使下游基因開放表達(dá)。但是這些開放的基因

2、是什么，它們?nèi)绾斡绊懠?xì)胞分化等相關(guān)問題有待進(jìn)一步研究。 我們通過研究APL細(xì)胞株NB4在ATRA誘導(dǎo)分化時(shí)的mRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)了一批基因，其中Rig-I(維甲酸誘導(dǎo)基因I)可以被ATRA明顯上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Rig-ImRNA和蛋白質(zhì)水平均在3-6小時(shí)明顯上調(diào)，并且Rig-I上調(diào)和NB4細(xì)胞的分化高度一致。在ATRA耐藥細(xì)胞株NB4-R2中沒有Rig-I的上調(diào)。提示Rig-I是粒系分化的關(guān)鍵。 為了證實(shí)Rig-I對(duì)粒細(xì)

3、胞發(fā)育的重要性，我們敲除了小鼠Rig-I基因組的第4-8外顯子。早在8-12周齡的Rig-I<'-/->小鼠就可以表現(xiàn)出明顯的造血異常。在大體解剖上表現(xiàn)為脾臟輕到中度增大。骨髓和外周血細(xì)胞總數(shù)并沒有明顯改變。然而，通過流式細(xì)胞術(shù)分析造血細(xì)胞各系發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞明顯增生。骨髓和脾臟中都可以看到造血干細(xì)胞(Lin<'->，Sca-1<'+>，c-Kit<'+>)、髓系祖細(xì)胞(Gr-1<'low>，c-Kit<'+>)近倍增加。而Mac-1<'++

4、>，Gr-1<'++>的后期粒細(xì)胞明顯增加，同時(shí)Mac-1、Gr-1的表達(dá)強(qiáng)度略低于野生型小鼠，提示粒細(xì)胞的增生和一定程度的成熟障礙。與粒細(xì)胞相反，B細(xì)胞表現(xiàn)為生成減少和后期成熟明顯被阻滯。碘化丙錠(PI)和AnnexinV染色顯示Rig-I缺陷小鼠粒細(xì)胞同時(shí)有凋亡減少和增殖增加。外周血、骨髓和脾臟造血細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和流式細(xì)胞術(shù)檢查結(jié)果一致，都為環(huán)狀核粒細(xì)胞為主，并表現(xiàn)為部分的成熟障礙。體外半固體培養(yǎng)顯示，Rig-I缺陷小鼠對(duì)G-CSF

5、的反應(yīng)性降低，集落細(xì)胞的流式細(xì)胞分析顯示(Gr-1<'low>，c-Kit<'+>)比例增加，也提示粒細(xì)胞的分化受阻。相反，通過逆病毒載體在造血細(xì)胞過表達(dá)Rig-I后，表達(dá)Rig-I的細(xì)胞很快減少。 Rig-I缺陷小鼠在髓系造血上的變化很像融合基因PML／RARα和PLZF／RAR α轉(zhuǎn)基因小鼠完全發(fā)病前的造血改變，這提醒我們檢查了x-RARα轉(zhuǎn)基因小鼠磁珠分離的c-Kit、B220-、Terll 9、cD3細(xì)胞的的Rig-I表

6、達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其mRNA水平明顯降低。而且完全發(fā)病時(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠的CD34’細(xì)胞也有Rig-I的表達(dá)減少。我們通過熒光素報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)IRFl對(duì)Rig-I有轉(zhuǎn)錄激活作用，在預(yù)測(cè)的IRFl結(jié)合位點(diǎn)的單堿基突變即可破壞Rig-I的啟動(dòng)子活性。有趣的是，在IRF-l信號(hào)傳遞的下游就是TRAIL，它在ATRA誘導(dǎo)的APL細(xì)胞凋亡和IFN調(diào)節(jié)機(jī)制中具有重要作用。我們的數(shù)據(jù)顯示在Rig-I缺陷鼠和PML／RARα、PLzF／RARα轉(zhuǎn)基因小鼠的造血細(xì)胞或

7、白細(xì)胞細(xì)胞中IRFl和TRAIL的表達(dá)均明顯減少。這些都提示在APL細(xì)胞中融合蛋白XRARα可以通過影響IRFl下調(diào)TRAIL并使細(xì)胞獲得額外得生存優(yōu)勢(shì)從而導(dǎo)致發(fā)病。其中Rig-I的下調(diào)也起到了一定作用，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)Rig-I可以顯著增強(qiáng)IRFl、TRAIL和IFN β的啟動(dòng)子活性。此外，我們發(fā)現(xiàn)PIAsl、PML表達(dá)減少，而PIMl、STATl表達(dá)增加，它們?cè)谠煅{(diào)控和白血病發(fā)病中有重要作用。但是，Rig-I是如何引起這些改變的，Ri