全反式維甲酸與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞分化和凋亡作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:誘導(dǎo)分化治療是腫瘤化學(xué)治療的一個(gè)重要領(lǐng)域,它利用分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成為正常或接近正常的細(xì)胞,從而逆轉(zhuǎn)其增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性表型來達(dá)到治療腫瘤的目的。維甲酸類化合物是被研究和臨床應(yīng)用最為廣泛的分化誘導(dǎo)劑,其中全反式維甲酸(all-trans retinoid acid, ATRA)是第一個(gè)成功應(yīng)用于白血病治療的誘導(dǎo)分化藥物,能夠特異性誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, A

2、PL)細(xì)胞分化成熟,完全緩解率高達(dá)90％,而且不誘發(fā)彌漫性血管內(nèi)出血(disseminated intravascular coagulation, DIC),不引起骨髓抑制。ATRA的作用特點(diǎn)有別于傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物,其作用機(jī)理的研究一直受到國(guó)內(nèi)外專家的廣泛關(guān)注,并取得了重要成就。但是目前仍未有系統(tǒng)的理論解釋ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的分子機(jī)制,這也很大程度地限制了ATRA在臨床的廣泛應(yīng)用。因此進(jìn)一步研究維甲酸類藥物誘導(dǎo)細(xì)胞分化的分子

3、機(jī)制,具有重要的理論意義和應(yīng)用前景,是目前細(xì)胞分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑,因此泛素-蛋白酶體通路廣泛參與如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白的跨膜定位和細(xì)胞表面膜受體的內(nèi)化等多種生理過程,對(duì)細(xì)胞的增殖及惡變有重要影響。近年來,泛素-蛋白酶體通路與細(xì)胞分化之間的相關(guān)性正受到國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者日益廣泛

4、的關(guān)注。泛素-蛋白酶體通路在晶狀體上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的分化過程中發(fā)揮了重要的作用,但具體的作用機(jī)制又各有不同。2000年我國(guó)科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn),泛素-蛋白酶體通路相關(guān)的基因在ATRA處理的APL細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增加。此外,介導(dǎo)ATRA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的維甲酸受體RARa及其融合蛋白PML-RARa在ATRA作用過程中均由于泛素-蛋白酶體通路的降解而減少。由此可見,泛素-蛋白酶體通路在ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化過程中具有重要而復(fù)雜

5、的作用。但是,泛素-蛋白酶體通路與ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的相關(guān)性研究至今未見報(bào)道。因此,本研究將系統(tǒng)探討泛素-蛋白酶體通路在ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化中的作用,研究蛋白酶體抑制劑對(duì)ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的影響。具體研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分:
　　1)闡明ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化過程中,泛素-蛋白酶體通路活性變化,進(jìn)而分析抑制蛋白酶體活性對(duì)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的影響。
　　2)采用多種蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用,從

6、細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平系統(tǒng)評(píng)價(jià)兩藥聯(lián)合作用對(duì)白血病細(xì)胞分化的影響,并探討可能的分子作用機(jī)制。
　　3)在細(xì)胞水平研究ATRA與蛋白酶體抑制劑聯(lián)合作用誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制,以期為兩藥在臨床上合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　第一章全反式維甲酸對(duì)人急性髓性白血病細(xì)胞泛素-蛋白酶體通路活性的影響
　　目的:ATRA作為腫瘤誘導(dǎo)分化治療的成功范例,其復(fù)雜的作用機(jī)制一直是細(xì)胞分化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本課題通過研究ATRA誘導(dǎo)

7、白血病細(xì)胞分化過程中泛素-蛋白酶體通路活性變化,進(jìn)而分析抑制蛋白酶體活性對(duì)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的影響,力求系統(tǒng)闡明泛素-蛋白酶體通路在ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化過程中的重要作用。
　　方法與結(jié)果:ATRA作用后,人急性髓性白血病細(xì)胞HL60和NB4細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白表達(dá)水平均呈時(shí)間依賴性的變化趨勢(shì)。采用特異性蛋白酶體底物Suc-LLVY-AMC檢測(cè)ATRA作用后細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體水解活性變化,結(jié)果表明ATRA能夠明顯增強(qiáng)蛋白酶體的水解活

8、性,且呈時(shí)間依賴性關(guān)系,說明細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白水平的增加是ATRA作用的直接結(jié)果,而非蛋白酶體活性降低導(dǎo)致的。熒光定量PCR結(jié)果表明,ATRA作用后泛素mRNA水平也呈時(shí)間依賴性遞增趨勢(shì),其原因可能是為了滿足靶蛋白的泛素化標(biāo)記需求。上述泛素-蛋白酶體通路各組成成分的活性變化與ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化進(jìn)程具有高度的一致性,提示泛素-蛋白酶體通路可能參與調(diào)節(jié)ATRA誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化過程。于是我們采用蛋白酶體抑制劑MG132來研究泛素-蛋白酶

9、體通路與ATRA誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化的確切關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制ATRA對(duì)蛋白酶體的活化作用能明顯增強(qiáng)ATRA的誘導(dǎo)分化能力,說明增高的蛋白酶體活性并不利于ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制ATRA對(duì)蛋白酶體的激活作用可以阻止維甲酸受體RARa及其融合蛋白PML-RARa的泛素化降解使其得到累積,從而增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化作用。此外,采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使細(xì)胞高表達(dá)維甲酸受體RARa,觀察白血病細(xì)胞內(nèi)RARa蛋白表達(dá)水

10、平與細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感程度相關(guān)性。結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)RARa蛋白含量的增多不僅能顯著降低ATRA作用濃度,還能加速分化進(jìn)程,該結(jié)果證實(shí)細(xì)胞內(nèi)RARa表達(dá)水平?jīng)Q定了白血病細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感程度。
　　結(jié)論:全反式維甲酸在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化過程中能激活泛素-蛋白酶體通路,而顯著增強(qiáng)的蛋白酶體活性可能對(duì)ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化產(chǎn)生不利的影響,因?yàn)橐种艫TRA對(duì)蛋白酶體的活化作用能明顯促進(jìn)ATRA對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用,其作用機(jī)制可能

11、與抑制維甲酸受體RARa蛋白的泛素化降解密切相關(guān)。
　　第二章蛋白酶體抑制劑聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性髓性白血病細(xì)胞分化的藥效學(xué)評(píng)價(jià)及機(jī)制研究
　　目的:基于第一部分的研究結(jié)果,本研究將在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平進(jìn)一步確認(rèn)蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用對(duì)人急性髓性白血病的誘導(dǎo)分化治療作用,并探討可能的分子作用機(jī)制,以期為臨床上ATRA聯(lián)合用藥方案提供新的策略。
　　方法與結(jié)果:我們通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、NBT還原試驗(yàn)、瑞氏-吉姆薩

12、染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CDllb表達(dá)等方法,在細(xì)胞水平證實(shí)蛋白酶體抑制劑PS341、Lactacystin和LLnL能顯著促進(jìn)ATRA對(duì)人急性髓性白血病細(xì)胞HL60的誘導(dǎo)分化作用。采用人白血病HL60細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型在動(dòng)物水平證實(shí)PS341與ATRA聯(lián)合作用對(duì)白血病的誘導(dǎo)分化治療作用,兩藥聯(lián)合能顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng),具有良好的協(xié)同作用。采用Western blot檢測(cè)PS341與ATRA聯(lián)合作用后HL60細(xì)胞內(nèi)及裸小鼠

13、移植瘤組織中RARa蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明PS341能抑制RARa蛋白的泛素化降解使其累積,進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞分化。熒光定量PCR結(jié)果表明,蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用后能促進(jìn)RARa直接作用的靶基因STAT1和PU.1的基因轉(zhuǎn)錄,提示累積的RARa蛋白仍然具有生物學(xué)功能,與ATRA結(jié)合后能啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。蛋白酶體抑制劑還通過促進(jìn)C/EBPa和C/EBPε這兩個(gè)與髓性細(xì)胞分化密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),從而增強(qiáng)ATRA對(duì)白血病細(xì)

14、胞的誘導(dǎo)分化作用。此外,蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合作用能進(jìn)一步抑制c-Myc蛋白表達(dá),進(jìn)而影響c-Myc下游相關(guān)蛋白Cyclin E、p27等蛋白水平,從而增強(qiáng)ATRA對(duì)白血病細(xì)胞G0/G1期阻滯作用。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)外水平證明蛋白酶體抑制劑能夠明顯促進(jìn)ATRA對(duì)人急性髓性白血病的誘導(dǎo)分化治療作用,具有良好的協(xié)同效果。其作用機(jī)制可能是通過抑制維甲酸受體RARa的泛素化降解使其得到累積,進(jìn)而促進(jìn)下游與分化相關(guān)基因(STAT

15、1和PU.1)的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)細(xì)胞分化。蛋白酶體抑制劑還通過調(diào)節(jié)C/EBPa、C/EBPε、c-Myc、Cyclin E、p21和p27等蛋白表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)ATRA對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。
　　第三章蛋白酶體抑制劑聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性髓性白血病細(xì)胞凋亡作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:目前,ATRA結(jié)合化療的治療手段已成為急性髓性白血病治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。作為第一個(gè)成功應(yīng)用于臨床蛋白酶體抑制,PS341表現(xiàn)出了顯著的

16、抗腫瘤治療作用。我們?cè)谇皟刹糠盅芯恐杏^察到,在適當(dāng)?shù)臐舛认?對(duì)白血病細(xì)胞幾乎沒有殺傷作用),蛋白酶體抑制劑能夠明顯促進(jìn)ATRA對(duì)人急性髓性白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。因此我們希望觀察蛋白酶體抑制劑與ATRA聯(lián)合用藥對(duì)人急性髓性白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用,進(jìn)而全面掌握PS341與ATRA聯(lián)合應(yīng)用的作用效果與藥物濃度之間的相關(guān)性,同時(shí)觀察給藥順序?qū)伤幝?lián)合作用藥效的影響。
　　方法與結(jié)果:我們采用同時(shí)給藥和序貫給藥兩種方式觀察ATRA與蛋

17、白酶體抑制劑聯(lián)合作用對(duì)人急性髓細(xì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同時(shí)給藥方案ATRA與PS341具有協(xié)同誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用;而序貫給藥方式,ATRA預(yù)先作用后PS341對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用明顯受到抑制。通過比較PS341對(duì)正常的和經(jīng)ATRA預(yù)處理的NB4和HL60細(xì)胞蛋白酶體活性抑制情況,我們發(fā)現(xiàn)PS341均能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性,說明ATRA對(duì)蛋白酶體活性的激活作用并不參與調(diào)節(jié)ATRA誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑

18、制劑的耐受作用。通過Western blot檢測(cè)Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax和Mcl-1的蛋白水平變化。我們觀察到PS341作用后,Mcl-1蛋白呈時(shí)間依賴性遞增趨勢(shì),提示Mcl-1蛋白并不參與調(diào)節(jié)PS341誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程;而ATRA作用后細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax率顯著減少,但此時(shí)白血病細(xì)胞并沒有明顯的凋亡,說明這些蛋白并不是ATRA引起白血病細(xì)胞對(duì)PS341耐藥的影響因素。隨后,我們觀察到ATRA作用后細(xì)胞內(nèi)p-MEK、c

19、-FLIP和Procaspase-8蛋白水平較對(duì)照組明顯增高。采用PD98059抑制MEK的磷酸化,經(jīng)ATRA預(yù)處理的白血病細(xì)胞對(duì)PS341的耐受作用明顯減弱,此時(shí)ATRA對(duì)c-FLIP和Procaspase-8蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用也受到抑制,說明ATRA通過磷酸化激活MEK蛋白,進(jìn)而促進(jìn)c-FLIP和Procaspase-8蛋白表達(dá),從而抑制caspase-8引起的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)來抑制PS341對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。