氨肽酶N-CD13抑制劑烏苯美司增強(qiáng)全反式維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞分化作用及機(jī)制的研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)是急性髓細(xì)胞白血病(acutemyelogenousleukemia,AML)的一個(gè)特殊亞型，具有獨(dú)特的臨床、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)表現(xiàn)。由于臨床嚴(yán)重的出血傾向，早期死亡率很高。自1988年我國學(xué)者首先應(yīng)用全反式維甲酸(all-trans-retinoicacid，ATRA)對(duì)APL進(jìn)行誘導(dǎo)分化治療，APL的臨床轉(zhuǎn)歸發(fā)生了巨大的改變，對(duì)ATRA的高度敏感

2、性使APL成為臨床可治愈的AML亞型。然而單用ATRA治療維持緩解的時(shí)間短，容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)患者常對(duì)ATRA耐藥，以及ATRA應(yīng)用過程中的副反應(yīng)等，仍是APL治療中面臨的嚴(yán)重障礙。而且，ATRA對(duì)APL之外其它類型的AML療效差。因此，尋找能夠增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用的藥物，以及探索藥物增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用的分子機(jī)制一直是白血病分化治療研究中的熱點(diǎn)。 氨肽酶N/CD13(aminopeptidaseN/CD13，APN/CD1

3、3)是一種鋅離子依賴的金屬蛋白酶，在多種腫瘤包括AML細(xì)胞中均呈高表達(dá)。最近研究表明，APN/CD13不僅通過蛋白水解酶的活性發(fā)揮作用，還參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤侵襲等多種病理生理過程。Ubenimex為細(xì)胞表面APN/CD13和亮氨酸氨基肽酶的抑制劑，不僅通過增強(qiáng)宿主免疫功能、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用，ubenimex還具有刺激骨髓祖細(xì)胞生成和分化的作用。我們?cè)O(shè)想：Ubenimex對(duì)原代APL細(xì)胞以及其他髓系白血病細(xì)

4、胞是否具有同樣的效應(yīng)?Ubenimex能否恢復(fù)對(duì)ATRA耐藥的APL細(xì)胞株對(duì)ATRA的敏感性?Ubenimex作為細(xì)胞表面APN/CD13的靶向藥物，其與ATRA的作用途徑中是否存在共同的作用點(diǎn)?APN/CD13在其中又具有怎樣的作用?本研究共分二部分。一、APN/CD13抑制劑ubenimex對(duì)ATRA誘導(dǎo)分化作用的影響；二、APN/CD13抑制劑ubenimex增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化作用機(jī)制的研究。 在第一部分的研究

5、中，首先通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD13陽性表達(dá)率，以及RT-PCR法檢測(cè)PML-RARαmRNA的表達(dá)，分別了解ubenimex和ATRA的作用靶點(diǎn)在所采用的細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行初步的鑒定。NB4細(xì)胞、MR2細(xì)胞、HL-60細(xì)胞均高表達(dá)髓系分化抗原CD13，其陽性表達(dá)率分別為99.8％、99.5％、99.7％，同時(shí)作為陰性對(duì)照的K562細(xì)胞的CD13陽性表達(dá)率為3.36％；NB4細(xì)胞、MR2細(xì)胞具有PML-RARαmR

6、NA的表達(dá)，HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞不具有PML-RARαmRNA的表達(dá)。單用100μg/mlubenimex不能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞、原代APL細(xì)胞、MR2細(xì)胞、HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞的分化。在NB4細(xì)胞中，10nmol/LATRA單獨(dú)作用72h，NB4細(xì)胞出現(xiàn)部分分化的形態(tài)，與100μg/mlubenimex聯(lián)合處理72h，NB4細(xì)胞分化的形態(tài)表現(xiàn)更加明顯。10nmol/LATRA單獨(dú)處理72h，NB4細(xì)胞CD11b表達(dá)明顯增高

7、；100μg/mlubenimex與10mol/LATRA聯(lián)合處理72h，NB4細(xì)胞CD11b表達(dá)的增加更加明顯，與10nmol/LATRA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(60.6±9.2vs.32.0±5.5，p＜0.01)。藥物作用72h，一定濃度ubenimex(50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml)呈濃度依賴性增強(qiáng)10nmol/LATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞的NBT還原能力，與單用ATRA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17.6±2.

8、5vs.12.0±2.2，p＞0.05；23.5±3.2vs.12.0±2.2,p＜0.05；36.0±8.3vs.12.0±2.2，p＜0.01)；100μg/mlubenimex能夠增強(qiáng)不同濃度(10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞的NBT還原能力，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(32.3±9.4vs.12.4±2.5；40.7±5.3vs.15.7±2.6；50.8±5.5v

9、s.21.8±2.4；p＜0.01)。藥物作用48h-96h，100μg/mlubenimex呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)10nmol/LATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞的NBT還原能力，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)單用ATRA組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(23.0±5.0vs.8.9±1.8；32.0±7.1vs.14.4±0.8；61.4±4.0vs.17.2±1.2；p＜0.01)。表明ubenimex呈劑量和時(shí)間依賴性增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。

10、第二部分的研究表明ubenimex能夠增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞和初發(fā)APL細(xì)胞分化的作用。在第二部分的研究中，對(duì)ubenimex增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用的可能機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38mitogenactivatedproteinkinase，p38MAPK)的活化在ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。為了解p-p38MAPK在ubenimex增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化過程中的作用，通過Wester

11、nblot檢測(cè)ubenimex與ATRA處理后，p-p38MAPK表達(dá)的改變。藥物作用24h-96h，100μg/mlubenimex呈時(shí)間依賴性抑制NB4細(xì)胞p38MAPK的磷酸化水平。10nmol/LATRA單獨(dú)作用72h，引起NB4細(xì)胞p38MAPK的磷酸化，100μg/mlubenimex能夠抑制10nmol/LATRA引起的NB4細(xì)胞p38MAPK的磷酸化。表明ubenimex可能通過抑制ATRA引起的p38MAPK磷酸化，減

12、弱其負(fù)調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)ATRA的誘導(dǎo)分化作用。在MR2細(xì)胞中，盡管100μg/mlubenimex也呈時(shí)間依賴性抑制MR2細(xì)胞p38MAPK的磷酸化水平，但100nmol/LATRA作用72h，不引起MR2細(xì)胞p38MAPK的磷酸化。提示ubenimex不能恢復(fù)MR2細(xì)胞對(duì)ATRA誘導(dǎo)分化作用的敏感性，可能與MR2細(xì)胞不具有ubenimex發(fā)揮增強(qiáng)效應(yīng)的靶點(diǎn)有關(guān)，這也為ubenimex通過抑制p38MAPK的磷酸化來增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)N

13、B4細(xì)胞分化的作用提供了反證。5μg/ml抗APN/CD13抗體WM-15單獨(dú)引起NB4細(xì)胞p38MAPK的磷酸化；其與100μg/mlubenimex聯(lián)用，部分阻斷100μg/mlubenimex抑制NB4細(xì)胞p38MAPK磷酸化的作用。5μg/mlWM-15單獨(dú)處理不能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞的NBT還原能力，5μg/mlWM-15對(duì)10nmol/LATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞NBT的還原能力也沒有明顯影響，但5μg/mlWM-15預(yù)先處理能夠阻斷

14、100μg/mlubenimex增強(qiáng)10nmol/LATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞NBT的還原能力(12.8±5.2vs.40.3±6.3，p＜0.01)。表明ubenimex可能通過細(xì)胞表面APN/CD13的介導(dǎo)，抑制NB4細(xì)胞p38MAPK的磷酸化，達(dá)到增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化的作用。原癌基因c-myc表達(dá)的下調(diào)與ATRA誘導(dǎo)多種髓系白血病細(xì)胞的分化過程均有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，藥物作用4h，100μg/mlubenimex協(xié)同10nmol/LATR

15、A下調(diào)c-mycmRNA的表達(dá)，與單用10nmol/LATRA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.36±0.11vs.0.68±0.05，p＜0.05)。藥物作用8h，一定濃度ubenimex呈劑量依賴性增強(qiáng)10nmol/LATRA下調(diào)c-Myc蛋白的表達(dá)；且不同濃度ubenimex與10nmol/LATRA聯(lián)合應(yīng)用各組c-Myc蛋白的表達(dá)水平與NBT還原能力之間呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.940，p=0.017)。表明ubenimex協(xié)同ATR

16、A下調(diào)c-myc的表達(dá)可能與其增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化的作用有關(guān)。10nmol/LATRA單獨(dú)或與100μg/mlubenimex聯(lián)合處理12h，NB4細(xì)胞CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancerbindingprotein，C/EBPε)mRNA的表達(dá)水平均明顯提高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；但該兩組間無明顯差異。提示ubenimex可能不通過對(duì)C/EBPεmRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)增強(qiáng)ATRA的誘導(dǎo)分化作用

17、。 綜上所述，本研究得出結(jié)論如下：1、Ubenimex呈劑量和濃度依賴性增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用，并能增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)初發(fā)APL原代細(xì)胞分化的作用；2、Ubenimex單獨(dú)應(yīng)用可以抑制NB4細(xì)胞和MR2細(xì)胞p38MAPK的磷酸化水平；3、Ubenimex可以抑制ATRA所引起的NB4細(xì)胞p38MAPK的磷酸化；4、抗CD13抗體部分阻斷ubenimex抑制NB4細(xì)胞p38MAPK磷酸化的作用；5、抗CD13抗體阻斷u