急性早幼粒白血病細(xì)胞分化相關(guān)信號(hào)途徑及關(guān)鍵基因RIG-G功能的研究.pdf

1、RIG-G(retinoicacid-inducedgeneG)是我們多年前從急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)細(xì)胞株NB4中克隆得到的一系列可被維甲酸誘導(dǎo)表達(dá)的基因之一。前期的研究工作已經(jīng)證明，RIG-G能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G1期，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。此外，RIG-G還能與COP9信號(hào)體(COP9signalosome，CSN)復(fù)合物的第五個(gè)亞基CSN5發(fā)生

2、相互作用。
　　CSN復(fù)合物是一個(gè)由CSN1～CSN8八個(gè)亞基構(gòu)成的多蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄激活、DNA修復(fù)以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，CSN復(fù)合物具有三種生物學(xué)活性:金屬蛋白酶活性、去泛素化活性和蛋白激酶活性，主要表現(xiàn)在:(1)可以去除CRLs(cullin-RINGligases，CRL)E3連接酶cullin亞基上的Nedd8修飾（也稱為Deneddylation），使CRLs失活，

3、從而維持CRLs各亞基的穩(wěn)定性;(2)在缺乏底物時(shí)，可以通過募集去泛素化酶抑制CRLs亞基的自身泛素化，防止其被蛋白酶體降解;(3)此外，還能通過一些蛋白激酶使相關(guān)的蛋白底物發(fā)生磷酸化，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們以前的研究結(jié)果顯示，RIG-G可以通過與CSN5相互作用將CSN5蛋白部分阻滯在胞漿中，從而影響由CSN5介導(dǎo)的p27的出核，抑制p27通過泛素蛋白酶體途徑降解，使細(xì)胞內(nèi)的p27水平上升。由于CSN5不但能以單體的形式獨(dú)立發(fā)揮作

4、用，還可以作為一個(gè)重要的亞基參與形成CSN復(fù)合物來(lái)行使功能，那么RIG-G是否會(huì)影響CSN復(fù)合物的組成和功能呢？
　　在本論文的第一部分中，我們利用非變性凝膠電泳以及凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn)研究了RIG-G對(duì)CSN復(fù)合物的影響，發(fā)現(xiàn)RIG-G能破壞CSN復(fù)合物的組成，明顯下調(diào)CSN復(fù)合物的量，并抑制CSN復(fù)合物的功能。我們的結(jié)果顯示，RIG-G可以降低CSN復(fù)合物的Deneddylation能力，進(jìn)而使SCFβTrCP-E3連接酶的穩(wěn)定性

5、下降，其底物的泛素化降解受抑。RIG-G也可以抑制CSN復(fù)合物的去泛素化活性和蛋白激酶活性，使SCF-E3酶的底物受體亞基βTrCP的泛素化水平上升，c-Jun的磷酸化水平下降。
　　在本論文的第二部分中，為了進(jìn)一步揭示RIG-G抗增殖促分化的分子作用機(jī)制，我們通過二維電泳-聯(lián)合MALDI-TOF(Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization-Time-of-Flight)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)RIG-G

6、表達(dá)前后U937細(xì)胞內(nèi)核蛋白和漿蛋白表達(dá)譜的變化分別進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。我們共發(fā)現(xiàn)了49個(gè)受RIG-G影響的蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞骨架、氧化應(yīng)激、蛋白合成降解、基因轉(zhuǎn)錄、糖代謝、細(xì)胞增殖等相關(guān)蛋白。我們注意到，過表達(dá)RIG-G可以引起組氨酸釋放因子(histamine-releasingfactor,HRF)的蛋白水平下降，也可以使切絲蛋白(cofilin1，CFL1)和凝血素(galectin1，Gal1)的蛋白水平上升。由于這些蛋白均與

7、細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)，很可能在RIG-G抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮一定作用。這部分研究結(jié)果為我們進(jìn)一步探討RIG-G的功能及其作用的分子機(jī)制提供了重要線索。
　　在本論文的第三部分中，我們?cè)谇捌诠ぷ鞯幕A(chǔ)上，主要對(duì)APL細(xì)胞分化中cAMP信號(hào)途徑與維甲酸耐藥之間的關(guān)系進(jìn)行了深入研究。
　　APL是一種臨床表現(xiàn)極其兇險(xiǎn)的白血病類型。雖然目前臨床上使用全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)治療

8、APL患者已取得了巨大成功，但是仍有部分病人在ATRA治療后復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后往往失去對(duì)ATRA的反應(yīng)性。因此有關(guān)APL細(xì)胞的維甲酸耐藥性一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在以前的工作中，我們?cè)l(fā)現(xiàn)維甲酸敏感的NB4細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量明顯高于維甲酸耐藥的NB4-R1細(xì)胞。不僅如此，ATRA還能在短時(shí)間內(nèi)使NB4細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平進(jìn)一步升高，而NB4-R1細(xì)胞則未見此現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究表明，APL細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平與腺苷酸環(huán)化酶(adenyl

9、atecyclase，AC)的活性密切相關(guān)。AC的激動(dòng)劑能明顯增加NB4-R1細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量，并協(xié)同ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化。而AC的抑制劑則能使NB4細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量下降，且能阻斷ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。在本研究中，我們對(duì)NB4和NB4-R1細(xì)胞中部分AC亞型的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)NB4-R1細(xì)胞中AC9亞型的蛋白水平明顯低于NB4細(xì)胞。RNA干擾和過表達(dá)AC9的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也顯示AC9蛋白能直接影響細(xì)胞內(nèi)的cAMP

10、水平。進(jìn)一步的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則證明AC9蛋白的水平受到了細(xì)胞內(nèi)microRNA（如miR-X）的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，miR-X能負(fù)調(diào)控AC9蛋白的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。此外，我們還收集了部分處于不同治療階段的APL病人的骨髓細(xì)胞，通過Real-timePCR等方法對(duì)這些標(biāo)本中miR-X和AC9的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，miR-X和AC9的水平有可能可以作為評(píng)價(jià)APL病人治療療效的一個(gè)指標(biāo)。
　　通過本課題的研究，我們首次發(fā)現(xiàn)RIG