急性早幼粒白血病細胞分化相關信號途徑及關鍵基因RIG-G功能的研究.pdf

1、RIG-G(retinoicacid-inducedgeneG)是我們多年前從急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)細胞株NB4中克隆得到的一系列可被維甲酸誘導表達的基因之一。前期的研究工作已經證明，RIG-G能夠將細胞阻滯在細胞周期的G1期，具有抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞分化的功能。此外，RIG-G還能與COP9信號體(COP9signalosome，CSN)復合物的第五個亞基CSN5發(fā)生

2、相互作用。
　　CSN復合物是一個由CSN1～CSN8八個亞基構成的多蛋白復合體，在細胞周期調控、轉錄激活、DNA修復以及細胞信號轉導等多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，CSN復合物具有三種生物學活性:金屬蛋白酶活性、去泛素化活性和蛋白激酶活性，主要表現(xiàn)在:(1)可以去除CRLs(cullin-RINGligases，CRL)E3連接酶cullin亞基上的Nedd8修飾（也稱為Deneddylation），使CRLs失活，

3、從而維持CRLs各亞基的穩(wěn)定性;(2)在缺乏底物時，可以通過募集去泛素化酶抑制CRLs亞基的自身泛素化，防止其被蛋白酶體降解;(3)此外，還能通過一些蛋白激酶使相關的蛋白底物發(fā)生磷酸化，參與細胞內的信號轉導。我們以前的研究結果顯示，RIG-G可以通過與CSN5相互作用將CSN5蛋白部分阻滯在胞漿中，從而影響由CSN5介導的p27的出核，抑制p27通過泛素蛋白酶體途徑降解，使細胞內的p27水平上升。由于CSN5不但能以單體的形式獨立發(fā)揮作

4、用，還可以作為一個重要的亞基參與形成CSN復合物來行使功能，那么RIG-G是否會影響CSN復合物的組成和功能呢？
　　在本論文的第一部分中，我們利用非變性凝膠電泳以及凝膠過濾層析實驗研究了RIG-G對CSN復合物的影響，發(fā)現(xiàn)RIG-G能破壞CSN復合物的組成，明顯下調CSN復合物的量，并抑制CSN復合物的功能。我們的結果顯示，RIG-G可以降低CSN復合物的Deneddylation能力，進而使SCFβTrCP-E3連接酶的穩(wěn)定性

5、下降，其底物的泛素化降解受抑。RIG-G也可以抑制CSN復合物的去泛素化活性和蛋白激酶活性，使SCF-E3酶的底物受體亞基βTrCP的泛素化水平上升，c-Jun的磷酸化水平下降。
　　在本論文的第二部分中，為了進一步揭示RIG-G抗增殖促分化的分子作用機制，我們通過二維電泳-聯(lián)合MALDI-TOF(Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization-Time-of-Flight)質譜技術對RIG-G

6、表達前后U937細胞內核蛋白和漿蛋白表達譜的變化分別進行了比較系統(tǒng)的研究。我們共發(fā)現(xiàn)了49個受RIG-G影響的蛋白質，包括細胞骨架、氧化應激、蛋白合成降解、基因轉錄、糖代謝、細胞增殖等相關蛋白。我們注意到，過表達RIG-G可以引起組氨酸釋放因子(histamine-releasingfactor,HRF)的蛋白水平下降，也可以使切絲蛋白(cofilin1，CFL1)和凝血素(galectin1，Gal1)的蛋白水平上升。由于這些蛋白均與

7、細胞生長密切相關，很可能在RIG-G抑制細胞增殖促進細胞分化的過程中發(fā)揮一定作用。這部分研究結果為我們進一步探討RIG-G的功能及其作用的分子機制提供了重要線索。
　　在本論文的第三部分中，我們在前期工作的基礎上，主要對APL細胞分化中cAMP信號途徑與維甲酸耐藥之間的關系進行了深入研究。
　　APL是一種臨床表現(xiàn)極其兇險的白血病類型。雖然目前臨床上使用全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)治療

8、APL患者已取得了巨大成功，但是仍有部分病人在ATRA治療后復發(fā)，且復發(fā)后往往失去對ATRA的反應性。因此有關APL細胞的維甲酸耐藥性一直是該領域的研究熱點之一。在以前的工作中，我們曾發(fā)現(xiàn)維甲酸敏感的NB4細胞內cAMP的含量明顯高于維甲酸耐藥的NB4-R1細胞。不僅如此，ATRA還能在短時間內使NB4細胞內的cAMP水平進一步升高，而NB4-R1細胞則未見此現(xiàn)象。進一步的研究表明，APL細胞內的cAMP水平與腺苷酸環(huán)化酶(adenyl

9、atecyclase，AC)的活性密切相關。AC的激動劑能明顯增加NB4-R1細胞內cAMP的含量，并協(xié)同ATRA誘導細胞分化。而AC的抑制劑則能使NB4細胞內的cAMP含量下降，且能阻斷ATRA對NB4細胞的誘導分化作用。在本研究中，我們對NB4和NB4-R1細胞中部分AC亞型的表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)NB4-R1細胞中AC9亞型的蛋白水平明顯低于NB4細胞。RNA干擾和過表達AC9的轉染實驗也顯示AC9蛋白能直接影響細胞內的cAMP

10、水平。進一步的報告基因實驗則證明AC9蛋白的水平受到了細胞內microRNA（如miR-X）的轉錄后調控，miR-X能負調控AC9蛋白的表達和細胞內cAMP的水平。此外，我們還收集了部分處于不同治療階段的APL病人的骨髓細胞，通過Real-timePCR等方法對這些標本中miR-X和AC9的表達水平進行檢測。結果提示，miR-X和AC9的水平有可能可以作為評價APL病人治療療效的一個指標。
　　通過本課題的研究，我們首次發(fā)現(xiàn)RIG