蛋白酶體抑制劑硼替佐米對急性髓性白血病的分化治療作用及其機制研究.pdf

1、研究目的:硼替佐米(萬珂,Bortezomib/velcade)是一種二肽硼酸衍生物,是第一個由美國食品藥物管理局(FDA)批準上市的蛋白酶體抑制劑,對多發(fā)性骨髓瘤的治療具有較高的總體有效率和完全緩解率。Bortezomib抗瘤譜廣,研究表明Bortezomib能誘導急性髓性白血病細胞(AML)發(fā)生凋亡,且單藥或聯(lián)合其他化療藥物治療白血病均具有一定的臨床療效,但其作用機制闡釋尚不明確。隨著對細胞分化異常在惡性腫瘤發(fā)病學和治療學上的意義認

2、識的日益加深,腫瘤的分化治療成為當今腫瘤學研究的熱點之一。其中,全反式維甲酸(ATRA)誘導分化治療急性早幼粒白血病(M3, APL)療法,已列為誘導緩解APL的首選方案之一,但ATRA耐藥、嚴重毒副反應以及復發(fā)等仍是當前迫切需要解決的問題。因此,尋找高效低毒的新型分化誘導劑或?qū)ふ矣行У乃幬锫?lián)用方案是解決上述問題的關(guān)鍵途徑。基于此,本研究探討了Bortezomib單藥或聯(lián)合ATRA在誘導分化治療AML中的藥效及其作用機制。研究內(nèi)容主要包

3、含了兩個部分:(1) Bortezomib對急性髓性白血病細胞的誘導分化作用及其作用機制研究;(2) Bortezomib聯(lián)合ATRA對急性髓性白血病的協(xié)同治療作用,并探究了維甲酸受體RARα通路在該過程中所發(fā)揮的作用。研究方法:1)選用人白血病細胞株HL60和U937為主要研究對象,人原代急性髓性白血病細胞為輔助研究對象,考察了Bortezomib對AML細胞的分化誘導作用:采用臺盼藍染色結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)觀察細胞增殖情況,描繪細胞

4、增殖曲線;應用吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學改變;采用硝基四氮唑藍(NBT)測試細胞還原能力;細胞經(jīng)CD14-FITC或CD11b-PE抗體孵育后采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CD14或CD11b表達;應用Western blotting檢測MAPK家族蛋白表達及活化水平(p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-p38、MEK、JNK2、p38),檢測分化啟動因子STAT1表達及活性水平(p-STAT1 Try701、STAT1);應用R

5、ealtime PCR檢測細胞STAT1 mRNA表達水平,并利用CHX抑制蛋白合成研究Bortezomib引起的STAT1蛋白上調(diào)的原因;用攜帶shRNA-STAT1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HL60細胞,通過沉默STAT1研究其在Bortezomib誘導的AML細胞分化中的關(guān)系。利用MEK特異性抑制劑PD98059、JNK特異性抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580研究MAPK通路在Bortezomib誘導的AML細胞分化中的關(guān)

6、系;采用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)測定Bortezomib對AML細胞的凋亡率及初步探討B(tài)ortezomib誘導的細胞分化與凋亡的關(guān)系。2)選用人白血病細胞株HL60和NB4為主要研究對象,人原代急性髓性白血病細胞為輔助研究對象,考察Bortezomib與ATRA對AML細胞的聯(lián)合治療作用:采用臺盼藍染色結(jié)合血細胞計數(shù)板計數(shù)觀察細胞增殖情況和細胞存活率,描繪細胞增殖曲線;應用吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學改變;采用硝

7、基四氮唑藍(NBT)測試細胞還原能力;細胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面分化抗原CDllb表達;采用HL60細胞裸小鼠移植瘤模型考察Bortezomib與ATRA在體內(nèi)的聯(lián)合治療作用;采用免疫組化法檢測瘤組織切片C/EBPε的蛋白表達含量;采用TUNEL法考察瘤組織切片中凋亡情況;應用Western blotting檢測RARα蛋白表達情況,檢測相關(guān)分化轉(zhuǎn)錄因子的表達(p-STAT1 Try701、STAT1、c

8、-Myc、C/EBPε、p-27),檢測MAPK家族蛋白表達情況(p-MEK、p-JNK);應用Realtime PCR檢測細胞RARα、STAT1 mRNA表達水平;采用免疫熒光法檢測p65和STAT1在細胞內(nèi)的定位;采用非放射性凝膠遷移法檢測STAT1與DNA的結(jié)合能力;用慢病毒介導的STAT1 shRNA轉(zhuǎn)染HL60細胞,通過沉默STAT1研究其在Bortezomib與ATRA聯(lián)用治療AML中的作用。研究結(jié)果:第一部分:Borte

9、zomib通過上調(diào)MEK/ERK-JNK p46通路活性,激活STAT1從而誘導AML細胞向單核/巨噬系細胞分化。1) Bortezomib具有誘導人急性髓性白血病細胞向單核/巨噬系細胞分化成熟的能力。用細胞增殖抑制率、細胞形態(tài)學、生化指標、分子標志等指標觀察Bortezomib對AML細胞的誘導分化成熟能力。結(jié)果顯示Bortezomib(5 nM)能誘導人急性髓性白血病(AML)細胞向單核/巨噬系細胞分化。Bortezomib(5 n

10、M)可顯著抑制HL60和U937細胞增殖,第3天的抑制率分別為44.6％和60.6%。吉姆薩染色結(jié)果表明Bortezomib(5 nM)作用72小時后,HL60細胞和U937細胞分化成為幼稚單核細胞或成熟單核細胞,形態(tài)學上表現(xiàn)為胞體變小,核/漿比例下降,細胞核固縮,部分呈半月核,細胞中核仁減少或消失。Bortezomib作用后的HL60和U937對NBT的還原能力增強,并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。同時Bortezomib誘導的分化抗原CD11

11、b/CD14的表達也呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性關(guān)系。此外,Bortezomib對人原代急性髓性白血病細胞(M3-AML, APL)增殖也有顯著的抑制作用,吉姆薩染色表明Bortezomib具有誘導人原代急性髓性白血病細胞成熟分化的能力。2) Bortezomib誘導AML細胞分化成熟的機制研究Western blotting檢測結(jié)果顯示,Bortezomib能激活MAPK通路(包括MEK/ERK級聯(lián)反應、JNK p46通路和p38通路)

12、,p-MEK、p-ERK、p-JNK p46、p-p38均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,并呈現(xiàn)時間依賴性關(guān)系,而其相應的原型蛋白表達水平不變。當給予MEK特異性抑制劑PD98059或JNK特異性抑制劑SP600125時,Bortezomib引起的MEK、ERK或JNK p46的活化被抑制,同時CDl4和CD11b的表達分別從Bortezomib單藥組的27.3%和35.8%下降到對照組水平。此外,PD98059同時抑制了Bortezomib引起的JNK

13、 p46的活化,但SP600125對MEK活性無影響。當給與p38特異性抑制劑SB203580時,Bortezomib誘導的CD14和CD11B的表達率為42.6%和56.0%,提示了p38可能對Bortezomib誘導的AML細胞的分化起到負調(diào)控作用。以上結(jié)果證明了MEK/ERK-JNK通路參與介導Bortezomib誘導的AML細胞分化。Western blotting檢測結(jié)果表明,Bortezomib誘導AML細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因

14、子STAT1的蛋白水平與活性形式pSTAT1 Tyr701均呈時間依賴性上調(diào)。Realtime PCR檢測結(jié)果表明STAT1 mRNA的表達也呈時間依賴性增加。給與CHX抑制STAT1 mRNA的表達,Bortezomib作用后,STAT1蛋白水平仍有所上調(diào),提示Bortezomib同時抑制了STAT1蛋白的降解。此外我們也觀察到STAT1下游基因C/EBPα蛋白的上調(diào)。慢病毒介導的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了HL60細胞中的STA

15、T1蛋白水平,Bortezomib作用于shRNA空載轉(zhuǎn)染的HL60細胞72小時后,CD14和CD11B的表達率分別為20.4%和39.6%,而在shRNA-STAT1轉(zhuǎn)染的細胞中,Bortezomib誘導的CD14和CD11b僅為10.1%和19.6%。給與PD98059或SP600125抑制Bortezomib引起的HL60細胞分化的同時,觀察到STAT1水平上調(diào)被抑制,活性水平被抑制,C/EBPa表達也受到抑制。上述結(jié)果表明Bor

16、tezomib激活的MEK/ERK-JNK通路可能通過進一步激活分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT1誘導AML細胞的分化。3) Bortezomib誘導的AML細胞分化與凋亡為RARα非依賴的過程。Western blotting結(jié)果顯示,Bortezomib作用于HL60后,維甲酸受體RARa蛋白水平增加,但通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示,RARa轉(zhuǎn)錄活性無顯著變化。同時流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明Bortezomib能誘導RARa突變的HL60

17、R細胞分化抗原CD11b的表達及凋亡的發(fā)生。以上結(jié)果提示Bortezomib誘導AML細胞的分化與凋亡是RARα非依賴的過程。4) Bortezomib誘導AML細胞分化的同時,伴隨著AML細胞的凋亡,并初步探討B(tài)ortezomib引起的AML細胞分化與凋亡之間的關(guān)系。Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,5 nM Bortezomib在誘導白血病細胞分化的同時,伴隨了時間依賴性的細胞凋亡。但由MEK/ERK-JNK通路的

18、抑制引起的Bortezomib細胞分化的抑制過程中,Bortezomib引起的細胞凋亡率無顯著性變化。由此推測,Bortezomib誘導的AML細胞的分化與凋亡可能是兩個相對獨立的過程。第二部分:Bortezomib通過抑制ATRA引起的RARa蛋白的降解,協(xié)同ATRA誘導AML細胞粒性分化。1) Bortezomib協(xié)同ATRA誘導AML細胞粒性分化。MTT檢測法顯示Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用能協(xié)同抑制HL60與NB4細胞

19、的增殖。通過臺盼藍拒染法與血細胞計數(shù)板法,計數(shù)并繪制Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用后的細胞的增殖曲線和存活率曲線。結(jié)果顯示Bortezomib(在HL60細胞上選用濃度2.5 nM,在NB4細胞上選用濃度2.5、5 nM)單藥作用不影響細胞的存活率和細胞增殖能力,但能顯著增強ATRA引起的細胞增殖抑制作用,而這種作用并不是通過誘導細胞死亡實現(xiàn)的。我們從形態(tài)學、生化指標及分子標志三方面指標證實了Bortezomib能促進ATRA誘

20、導的HL60、NB4細胞的分化,具體表現(xiàn)為與ATRA單用組相比,藥物聯(lián)用組引起的核分葉比例顯著增加,NBT還原能力顯著增強,分化抗原CDllb表達量顯著增加。在人原代白血病細胞上,ATRA與Bortezomib也具有協(xié)同作用。在M3-AML型、AML/ALL混合型、AML-resistance型三個原代病人骨髓中分離得到原代白血病。通過細胞計數(shù)或CCK8檢測,結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合作用后細胞存活率顯著低于單用組。在M3-AML型原代病人樣本上

21、,Bortezomib增強了ATRA引起的細胞NBT還原能力。2) Bortezomib聯(lián)合ATRA通過誘導HL60細胞分化,抑制裸小鼠HL60移植瘤的生長。裸小鼠HL60人白血病細胞移植瘤實驗結(jié)果顯示,ATRA(5 mg/kg)組及Bortezomib(0.1 mg/kg)組均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用,其T/C%值分別為58.0%和62.0%,抑瘤率分別為40.0%和20.0%,聯(lián)合作用組T/C%值和抑瘤率分別為45%和58.9%,說明

22、Bortezomib與ATRA在體內(nèi)也有較好抗腫瘤協(xié)同作用。通過分離得到瘤組織單細胞懸液,通過流式細胞術(shù)檢測,顯示聯(lián)用組瘤組織中分化抗原CD11b的表達率為53.1%,顯著高于ATRA單用組(40.4%)和Bortezomib單用組(38.6%)。從免疫組化結(jié)果也得出類似的結(jié)果,在聯(lián)用組中C/EBPε的表達量明顯高于對照組與單藥組。此外,采用TUNEL染色檢測了瘤組織中的凋亡情況,顯示該劑量配比下,瘤組織中幾乎檢測不到凋亡的發(fā)生。3)

23、Bortezomib協(xié)同ATRA誘導AML細胞分化的機制研究20S蛋白酶體活性檢測結(jié)果表明,蛋白酶體活性在ATRA誘導的HL60和NB4細胞分化過程中明顯上調(diào),Bortezomib顯著抑制了這一上調(diào)現(xiàn)象。與之對應的,在ATRA誘導的HL60和NB4細胞分化過程中RARα蛋白經(jīng)泛素蛋白酶體通路介導呈下調(diào)趨勢,Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用后,RARα蛋白得以累積,而其mRNA水平無顯著性變化。RARα與維甲酸反應元件RARE結(jié)合能

24、直接介導轉(zhuǎn)錄因子STAT1的表達。ATRA能誘導STAT1的表達,Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用后,STAT1 mRNA水平顯著增加。以上結(jié)果提示了Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,增強了RARα轉(zhuǎn)錄活性。Western blotting檢測瘤組織中RARα蛋白的表達含量,結(jié)果顯示Bortezomib抑制了ATRA引起的RARα蛋白的降解,聯(lián)用組中RARα蛋白含量顯著高于ATRA單用組。Western

25、blotting結(jié)果顯示ATRA上調(diào)了STAT1蛋白水平和Tyr701位點磷酸化水平,Bortezomib與ATRA聯(lián)合作用進一步上調(diào)STAT1的蛋白水平和活性,而該濃度Bortezomib單獨作用對其無顯著影響。免疫熒光結(jié)果顯示合用組細胞核中STAT1的分布顯著增加,EMSA檢測結(jié)果進一步證實提示了STAT1與DNA結(jié)合能力顯著增加。慢病毒介導的shRNA-STAT1顯著下調(diào)了HL60細胞中的STAT1蛋白水平,同時部分逆轉(zhuǎn)了Bort

26、ezomib對ATRA誘導的細胞分化的協(xié)同作用。以上結(jié)果顯示STAT1參與了Bortezomib協(xié)同ATRA誘導細胞分化的過程。免疫熒光結(jié)果顯示,p65在ATRA單用組、與Bortezomib聯(lián)用組細胞中的分布無顯著性差異。此外,ATRA或Bortezomib單用組中MEK活性增強,但聯(lián)用組與單用組MEK活性無顯著性差別。JNK通路活性在ATRA與Bortezomib聯(lián)合誘導細胞分化過程中變化不大。以上結(jié)果顯示了NFκB通路與MEK.

27、JNK通路在Bortezomib協(xié)同ATRA誘導細胞分化過程中不起關(guān)鍵性作用。結(jié)論:本論文較為系統(tǒng)地研究了Bortezomib誘導或促進ATRA誘導AML細胞分化治療中的作用,并對其機制進行了初步的探討。高濃度Bortezomib通過激活MEK/ERK-JNK通路啟動轉(zhuǎn)錄因子STAT1介導的AML細胞的單核/巨噬系分化。低濃度Bortezomib可以通過抑制ATRA引起的RARa的泛素化降解,提高RARa的轉(zhuǎn)錄活性,進而促進了STAT1