粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞自噬對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤發(fā)展的影響.pdf

1、目的：
　　觀察Lewis lung carcinoma（LLC）細(xì)胞株來源的細(xì)胞培養(yǎng)上清（tumor cell-conditioned medium，TCCM）對(duì)粒細(xì)胞樣髓源性抑制細(xì)胞（granulocytic myeloid-derived suppressor cells, G-MDSC）自噬的影響；研究腫瘤微環(huán)境下的G-MDSC自噬對(duì)其自身生存與免疫抑制功能的影響；研究G-MDSC自噬對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤發(fā)展的影響。

2、
　　方法：
　　1. G-MDSC分離及鑒定
　　構(gòu)建小鼠Lewi s肺癌移植瘤模型，磁珠分選脾臟G-MDSC，標(biāo)記細(xì)胞表面Ly-6G、Ly-6C和CD11b后，流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）檢測其純度；將分離得到的細(xì)胞涂片后進(jìn)行瑞士-吉姆薩復(fù)合染液染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2. LLC細(xì)胞株來源的TCCM的制備
　　Lewis細(xì)胞用含有10％NBCS（newborn calf se

3、rum）的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%的時(shí)候，用無血清的DMEM替換培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，收集上清。
　　3. TCCM抑制G-MDSC凋亡與上調(diào)ROS（Reactive oxygen species,ROS）
　　用不同濃度的TCCM處理G-MDSC12h、24h，AnnexinV/PI染色法，檢測細(xì)胞凋亡情況，DCFDA染色后FCM檢測對(duì)細(xì)胞效應(yīng)分子ROS的影響。
　　4. TCCM促進(jìn)G-MDS

4、C自噬的檢測
　　磁珠分選得到的G-MDSC在含有TCCM和氯喹（Chloroquine，CQ）的10% FBS（fatal bovine serum）RPMI1640刺激2h、4h，收集細(xì)胞，提取總蛋白，WB（western blot）檢測自噬小體形成標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ（light chain3Ⅱ）的水平。
　　5.自噬抑制G-MDSC凋亡的檢測
　　磁珠分選獲得G-MDSC，在含有TCCM和3-甲基腺嘌呤（3-Meth

5、yladenine，3-MA自噬的抑制劑）RPMI1640中培養(yǎng)12h、24h，收集細(xì)胞，AnnexinV/PI染色，F(xiàn)CM檢測自噬對(duì)G-MDSC生存的影響。
　　6.自噬上調(diào)G-MDSC功能的檢測
　　將G-MDSC在含TCCM和3-MA的RPMI1640中培養(yǎng)。
　　培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞，與小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)體系中加入抗CD3/CD28抗體，形成CD4+T細(xì)胞增殖體系，通過3H-胸腺嘧啶核苷（[3H

6、]-thymidine,3H-TdR）摻入法檢測CD4+T細(xì)胞增殖情況。
　　培養(yǎng)12h、24h，收集細(xì)胞，DCFDA染色后FCM檢測ROS的表達(dá)；提取總蛋白檢測精氨酸酶（arginase1，ARG1）活性。
　　7. G-MDSC自噬對(duì)小鼠Lewis肺癌移植瘤發(fā)展的影響
　　構(gòu)建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，分別在16、23d，尾靜脈注射3-MA阻斷自噬的G-MDSC，觀察小鼠移植瘤生長情況，F(xiàn)CM檢測分泌IFN-γ

7、的輔助性T細(xì)胞1型（helper T cell type1，Th1）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞1型（cytotoxic T lymphocytes type1,Tc1）的比例。
　　結(jié)果：
　　1.在體外，將不同濃度的TCCM加入到對(duì)G-MDSC培養(yǎng)體系中，F(xiàn)CM檢測刺激12h、24h對(duì)細(xì)胞生存與效應(yīng)分子ROS的影響。結(jié)果顯示TCCM有利于G-MDSC在體外存活，存在濃度依賴效應(yīng)；TCCM上調(diào)G-MDSCs的效應(yīng)分子ROS的水平。

8、r>　　2.將G-MDSC在含有TCCM和氯喹（Chloroquine，CQ）RPMI1640中培養(yǎng)2h、4h，WB檢測細(xì)胞中LC3Ⅱ水平。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，TCCM處理2、4h上調(diào)了胞內(nèi)LC3Ⅱ水平，表明了腫瘤微環(huán)境中， G-MDSC自噬的水平會(huì)上調(diào)（P<0.01）。
　　3.選取TCCM占培養(yǎng)體系體積的1/2來研究自噬對(duì)G-MDSC的影響，用3-MA抑制自噬，體外培養(yǎng)24h，觀察抑制自噬對(duì) G-MDSC在體外存活的影響。結(jié)

9、果顯示，與1/2TCCM組相比，1/2TCCM+3-MA組活細(xì)胞比例降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），表明抑制自噬，不利于G-MDSC在體外存活。
　　4.體外檢測G-MDSC對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示1/4TCCM+3-MA組與1/4TCCM組相比，在抑制了自噬后，G-MDSC對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用變?nèi)?，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。1/2TCCM+3-MA組與1/2TCCM組相比， G-MDSC

10、抑制CD4+ T細(xì)胞增殖作用變?nèi)酰Y(jié)果也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。表明抑制G-MDSC自噬后減弱了其對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　5.體外培養(yǎng)12h，提取細(xì)胞總蛋白，檢測ARG1活性結(jié)果顯示，1/2TCCM+3-MA組與1/2TCCM組相比，在抑制了自噬后，G-MDSC細(xì)胞中ARG1活性降低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。
　　6.體外培養(yǎng)12、24h，細(xì)胞染色后FCM檢測DCFDA平均熒光強(qiáng)度，以反映R

11、OS活性。結(jié)果顯示，1/2TCCM+3-MA組與1/2TCCM組相比，抑制自噬后，G-MDSC細(xì)胞中ROS活性呈下降趨勢。
　　7.造模22、24d時(shí)，1/2TCCM+3-MA處理組小鼠腫瘤體積明顯小于1/2TCCM誘導(dǎo)的G-MDSC處理組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）；第25d時(shí)，1/2TCCM+3-MA處理組小鼠腫瘤重量小于1/2TCCM誘導(dǎo)的G-MDSC處理組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），并且較1

12、/2TCCM誘導(dǎo)的G-MDSC組，1/2TCCM+3-MA處理組小鼠脾臟Tc1和Th1的比例均升高，Tc1升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。這些結(jié)果表明阻斷G-MDSC自噬能夠降低其免疫抑制功能，抗瘤免疫細(xì)胞的比例得到一定程度的恢復(fù)。
　　結(jié)論：
　　1. TCCM在體外對(duì)G-MDSC具有促進(jìn)生存、增強(qiáng)自噬、上調(diào)ROS的作用。
　　2.在體外，G-MDSC自噬能夠促進(jìn)細(xì)胞存活并且上調(diào)其對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的抑制作用，