爆發(fā)性肝炎小鼠中髓系衍生抑制性細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞活性影響的研究.pdf

1、爆發(fā)性肝炎發(fā)病迅速,病情重,死亡率高,是目前醫(yī)學(xué)難題之一。機(jī)體的免疫應(yīng)答異常是其特征,人體免疫系統(tǒng)功能的變化與肝炎的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著密切的聯(lián)系。肝臟中含有大量參與天然免疫應(yīng)答的細(xì)胞,如NK細(xì)胞、M(φ)、NKT和γdT細(xì)胞。近年來(lái),具有免疫抑制性的細(xì)胞亞群表型為Gr1+CD11b+的髓系衍生抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppress or cells,MDSCs)越來(lái)越受到研究人員的重視,MDSC是髓系來(lái)源的異質(zhì)性

2、細(xì)胞群體,包括髓系祖細(xì)胞和未成熟的髓系細(xì)胞。已有研究表明,MDSCs在機(jī)體腫瘤、炎癥和感染等疾病的免疫應(yīng)答中起負(fù)向調(diào)控作用。本研究就爆發(fā)性肝炎發(fā)展過(guò)程中MDSCs對(duì)固有免疫NK細(xì)胞的影響展開(kāi)研究。
　　 結(jié)合已有的研究報(bào)道,我們以C57/BL6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,制備了內(nèi)毒素引起的爆發(fā)性肝炎模型,基于該模型檢測(cè)爆發(fā)性肝炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,MDSCs與NK細(xì)胞數(shù)量比例以及NK殺傷活性變化,研究爆發(fā)性肝炎過(guò)程中MDSCs對(duì)NK細(xì)胞活性的

3、影響,以期對(duì)爆發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)制有更深入的了解,并為爆發(fā)性肝炎的防治提供一定的思路。
　　 第一部分:小鼠爆發(fā)性肝炎模型的建立與鑒定
　　 以C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)腹腔注射脂多糖(LPS)(5μg/kg)和D半乳糖胺(D-GalN)(450mg/kg)來(lái)制備小鼠爆發(fā)性肝炎模型,利用D-GalN輔助下的內(nèi)毒素中毒來(lái)?yè)p傷肝臟,模擬爆發(fā)性肝炎,檢測(cè)其肝炎的發(fā)生發(fā)展?fàn)顩r。
　　 首先,我們成功制備了小鼠爆發(fā)

4、性肝炎模型并觀察了其生存時(shí)間。造模小鼠在6.5h后部分出現(xiàn)死亡,7h-8h75％的小鼠死亡,并在10h內(nèi)全部死亡。利用該現(xiàn)象,我們進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠造模后0h、1.5h、3h和6h時(shí)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量,數(shù)據(jù)表明,小鼠腹腔注射LPS/D-GalN后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)血清AST和AIT的含量均顯著升高,6h時(shí)血清AST和ALT的含量均顯著高于1.5h和3h時(shí)血清AST和AET的含量。同時(shí),我們還對(duì)各時(shí)間點(diǎn)造模

5、小鼠的肝臟進(jìn)行了病理學(xué)檢查。病理切片顯示注射LPS/D-GalN1.5h肝臟病理切片示肝細(xì)胞有較多的核分裂,有散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);3h肝臟病理切片示肝細(xì)胞有較多的核分裂,有散在的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),部分區(qū)域呈小灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),有部分肝細(xì)胞死亡;6h肝臟病理切片示肝細(xì)胞有較多的核分裂,有較多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),局部呈小灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),其周?chē)写罅扛渭?xì)胞死亡。上述結(jié)果表明爆發(fā)性肝炎模型隨著時(shí)間的推移,肝臟炎癥顯著加重,逐漸出現(xiàn)肝臟壞死。

6、r>　　 第二部分:小鼠爆發(fā)性肝炎發(fā)展過(guò)程中MDSCs對(duì)NK細(xì)胞及其活性的影響
　　 我們從爆發(fā)性肝炎模型小鼠0h、1.5h、3h和6h時(shí)肝臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)組織中分離出單個(gè)核細(xì)胞,用FITC-anti-Gr1和PE-anti-CD11b抗體標(biāo)記細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Gr1+CD11b+MDSCs的細(xì)胞比例;用PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)CD

7、3-NK1.1+NK細(xì)胞的比例;用FITC-anti-NKG2D、PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟、脾臟和骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NKG2D+NK細(xì)胞的比例以及NKG2D的平均熒光強(qiáng)度。
　　 結(jié)果顯示,肝臟、脾臟、骨髓和淋巴結(jié)組織中的MDSCs隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展逐漸聚集,同時(shí)肝臟中的NK細(xì)胞數(shù)量隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展也不斷增加,且表達(dá)活化受體NKG2D的NK細(xì)胞比例在肝炎爆發(fā)狀

8、態(tài)時(shí)也出現(xiàn)了顯著升高,NK細(xì)胞活化受體NKG2D的平均熒光強(qiáng)度也隨著爆發(fā)性肝炎的發(fā)展顯著增強(qiáng)。表明了伴隨爆發(fā)性肝炎的發(fā)展,MDSCs及:NK細(xì)胞均逐漸增多,NK細(xì)胞活性也隨之加強(qiáng)。
　　 第三部分:小鼠爆發(fā)性肝炎發(fā)展過(guò)程中剔除MDSCs與對(duì)NK細(xì)胞的影響
　　 利用Rb6雜交瘤細(xì)胞,通過(guò)裸鼠制備具有MDSCs剔除功能的單克隆抗體,然后對(duì)制備的anti-Gr-1mAb進(jìn)行體內(nèi)剔除效果的鑒定。C57BL/6小鼠腹腔注射該單克

9、隆抗體后,小鼠肝臟、脾臟和骨髓中細(xì)胞Gr1+CD11b+MDSCs的細(xì)胞比例顯著下降至1％左右,剔除效果明顯。
　　 隨后以anti-Gr-1mAb制備MDSCs剔除的小鼠,在此基礎(chǔ)上,用PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)了爆發(fā)性肝炎模型6h時(shí)間點(diǎn)肝臟細(xì)胞中CD3+NK1.1+NK細(xì)胞的比例;并用FITC-anti-NKG2D、PE-anti-CD3e和PE-Cy5-anti

10、-NK1.1抗體標(biāo)記肝臟、脾臟和骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)爆發(fā)性肝炎模型6h時(shí)間點(diǎn)NKG2D+NK細(xì)胞的比例以及NKG2D的平均熒光強(qiáng)度。
　　 結(jié)果顯示,MDSCs剔除后爆發(fā)性肝炎6h時(shí)間點(diǎn)肝臟中NK細(xì)胞的比例顯著高于未剔除組同一時(shí)間點(diǎn)NK細(xì)胞的比例。另外,體內(nèi)剔除MDSCs后,小鼠爆發(fā)性肝炎6h時(shí)間點(diǎn)肝臟、脾臟和骨髓中NK細(xì)胞表達(dá)活化受體NKG2D的細(xì)胞比例與NKG2D的熒光強(qiáng)度均顯著降低,表明爆發(fā)性肝炎模型小鼠肝臟中MDSC