霉酚酸對(duì)肝臟NK細(xì)胞活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、背景和目的：隨著各種新型免疫抑制劑的開(kāi)發(fā)和使用，肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)大大減少，但肝移植術(shù)后乙肝病人經(jīng)歷一段HBV陰轉(zhuǎn)期后，正常移植肝仍可能再次感染HBV而致乙肝復(fù)發(fā)，可能與長(zhǎng)期使用免疫抑制劑導(dǎo)致肝臟免疫功能下降有關(guān)。在肝臟免疫系統(tǒng)中，肝臟NK細(xì)胞占肝臟總淋巴細(xì)胞的50％以上，是天然免疫的核心細(xì)胞，在抗腫瘤及病毒的免疫監(jiān)視中起著十分重要的作用，是肝臟免疫的第一道防線。近年來(lái)，NK細(xì)胞在機(jī)體抗HBV病毒感染中的作用(細(xì)胞毒和非細(xì)胞毒作用)

2、越來(lái)越得到關(guān)注。目前利用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠研究證實(shí)肝臟內(nèi)NK細(xì)胞在抗HBV感染中起著不可忽視的作用。因此肝臟NK細(xì)胞活性降低將嚴(yán)重削弱肝臟的抗病毒能力。肝移植術(shù)后一般常用免疫抑制劑霉酚酸酯(MMF)并聯(lián)用他克莫司(FK506)或環(huán)孢素A(CsA)，已有研究表明FK506和CsA對(duì)肝臟NK細(xì)胞活性有抑制作用，而MMF尚無(wú)報(bào)道。MMF是一種新型免疫抑制劑，它進(jìn)入體內(nèi)代謝為霉酚酸(MPA)后才發(fā)揮生物學(xué)效能，已有研究表明MPA體外能抑制HBV復(fù)

3、制，但矛盾的是MMF在臨床上對(duì)HBV復(fù)制卻并無(wú)抑制作用，這是否與霉酚酸抑制了肝臟NK細(xì)胞活性而導(dǎo)致肝臟抗病毒能力降低有關(guān)值得探討。因此研究霉酚酸對(duì)肝臟NK細(xì)胞活性影響及其相關(guān)機(jī)制對(duì)揭示肝移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)原因并探尋其防治方法均有重要意義。 二、材料和方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠及HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(清潔級(jí))，6-8周齡，雄性，體重16-20g 2.實(shí)驗(yàn)方法1)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)MMF30mg/kg.d-1灌胃10d(HBV轉(zhuǎn)基

4、因小鼠灌胃1M)，對(duì)照組用相同體積生理鹽水灌胃2)小鼠肝臟NK細(xì)胞分離純化(免疫磁珠法)3)體外實(shí)驗(yàn)加不同濃度MPA培養(yǎng)24h4)[3H]-TdR釋放法檢測(cè)肝臟NK細(xì)胞活性5)ELISA法檢測(cè)肝臟NK細(xì)胞分泌IFN-r、IL-2、IL-10水平6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比較小鼠肝臟NK細(xì)胞抑制性受體Ly49A、NKG2A和活化性受體NKG2D的表達(dá)情況7)RT-PCR檢測(cè)比較活化性受體NKp46的表達(dá)情況，并檢測(cè)主要影響受體的配體表達(dá)情況

5、 三、結(jié)果：1)不同濃度MPA處理后肝臟NK細(xì)胞殺傷活性較正常對(duì)照明顯降低(P＜0.01)，IFN-γ、IL-2分泌量降低，而IL-10分泌量增高，呈劑量依賴性。NK細(xì)胞活化性受體NKG2D、NKp46和抑制性受體Ly49A的表達(dá)下調(diào)，抑制性受體NKG2A的表達(dá)上調(diào)，高濃度的MPA作用后結(jié)果更明顯(P＜0.001)。IL-15、MPA共處理組肝臟NK細(xì)胞活性較MPA組明顯提高，活化性受體NKG2D的表達(dá)亦明顯上調(diào)(P＜0.05)。2)

6、MMF作用后小鼠肝臟NK細(xì)胞活性較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，而NK細(xì)胞活化性受體NKG2D及NKp46的表達(dá)下調(diào)，抑制性受體NKG2A的表達(dá)上調(diào)，但同時(shí)下調(diào)了抑制性受體Ly49A的表達(dá)。MMF還下調(diào)NKG2D配體Rae-1及肝內(nèi)IL-15mRNA的表達(dá)。 3)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞活性較正常對(duì)照明顯降低(P＜0.01)，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK表面活化性受體NKG2D表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，而抑制性受體Ly49A、

7、NKG2A和活化性受體NKp46表達(dá)與正常對(duì)照無(wú)顯著差異(P＞0.05)。MMF作用后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟NK細(xì)胞活性明顯降低(P＜0.05)，而對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBsAg滴度無(wú)影響(P＞0.05)。 四、結(jié)論：1.MPA體外能明顯抑制肝臟NK細(xì)胞活性，能抑制IFN-r、IL-2的分泌而促進(jìn)IL-10的分泌，使NKh1向NKh2轉(zhuǎn)化，呈劑量依賴性，其可能是通過(guò)下調(diào)活化性受體NKG2D和NKp46的表達(dá)并上調(diào)抑制性受體NKG2A

8、的表達(dá)而發(fā)揮作用，同時(shí)上述作用蓋過(guò)了MPA對(duì)抑制性受體Ly49A表達(dá)的下調(diào)作用。IL-15能通過(guò)上調(diào)肝臟NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的表達(dá)提高NK細(xì)胞活性從而逆轉(zhuǎn)MPA對(duì)肝臟NK細(xì)胞活性的抑制作用。 2.MMF體內(nèi)能明顯抑制肝臟NK細(xì)胞活性，可能是通過(guò)下調(diào)活化性受體NKG2D和NKp46的表達(dá)并上調(diào)抑制性受體NKG2A的表達(dá)而發(fā)揮作用，同時(shí)上述作用蓋過(guò)了MPA對(duì)抑制性受體Ly49A表達(dá)的下調(diào)作用。MMF還下調(diào)配體Rae-1及肝內(nèi)