自噬對慢性髓細胞性白血病中IFN1@抗腫瘤活性的影響.pdf

1、IFN1@（I型干擾素簇，也稱IFNα）作為慢性髓細胞性白血病(CML)的治療藥物，臨床上使得接近80％的早期慢性病人達到血液學(xué)緩解。但由于白血病治療中IFN1@耐藥的出現(xiàn)，常常影響白血病治療效果及預(yù)后。因此詳細了解IFN1@耐藥如何發(fā)生將有助于改善慢性髓細胞白血病治療方案以提升患者的療效及改善預(yù)后。我們前期研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬能增強CML細胞包括干細胞中伊馬替尼誘導(dǎo)的細胞毒性作用，表明白噬在CML的發(fā)生和治療中發(fā)揮重要作用。然而自噬是否及

2、如何調(diào)控CML細胞對IFN1@治療的敏感性目前尚不清楚。
　　本課題首先研究了IFN1@對CML細胞自噬的影響。以IFN1@處理K562細胞和原代CML細胞后，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)IFN1@以時間依賴方式增加細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)-Ⅱ的表達;透射電鏡也發(fā)現(xiàn)IFN1@處理后K562細胞中自噬泡（自噬小體/自噬溶酶

3、體）明顯增加;而免疫熒光及組織蛋白酶B活性分析分別證實IFN1@處理后LC3陽性囊泡(LC3 puncta)的表達及溶酶體酶活性均明顯增加。這些結(jié)果表明CML細胞中IFN1@具有自噬誘導(dǎo)劑的作用。
　　其次，我們研究了參與IFN1@誘導(dǎo)自噬的信號通路。通過基因轉(zhuǎn)染、shRNA抑制關(guān)鍵自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene，ATG)表達，Western blotting、免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制BECN1、

4、ATG5、ATG7能明顯減少IFN1@誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達和LC3 puncta的形成，而抑制ULK1不能發(fā)揮相關(guān)作用，表明BECN1、ATG5-ATG7自噬因子參與了IFN1@誘導(dǎo)的CML細胞自噬的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制JAK能減少STAT1磷酸化，減低STAT1的轉(zhuǎn)錄活性和LC3 puncta的形成;而抑制STAT1同樣能減少IFN1@誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ表達以及LC3 puncta的聚集。通過Western blotting及免疫

5、共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)RELA（也稱NFκB P65）shRNA能明顯減少IFN1@誘導(dǎo)的BECN1蛋白及mRNA表達以及BECN1與PtdIns3K的結(jié)合;而STAT1 shRNA除影響B(tài)ECN1與PtdIns3K結(jié)合外還影響了NFκB活化，表明活化的JAK1-STAT1-NFκB信號通路參與了IFN1@誘導(dǎo)的BECN1表達及BECN1與PtdIns3K的結(jié)合。
　　最后我們研究了抑制自噬對IFN1@誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的影響。通過流式細胞

6、術(shù)檢測細胞凋亡水平并以Western blotting檢測凋亡效應(yīng)因子CASP3活性，發(fā)現(xiàn)抑制自噬信號通路中關(guān)鍵因子ATG5、BECN1、ATG7和STAT1均可促進IFN1@誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡及CASP3活性增加，而這種作用在HL-60人急性髓細胞性白血病細胞株、Jurkat人T細胞急性淋巴細胞白血病細胞株中同樣存在。小分子自噬抑制劑氯喹能以劑量依賴方式增加IFN1@誘導(dǎo)的凋亡及CASP8活性，表明自噬在調(diào)控IFN1@誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮

7、重要作用。利用氯喹或shRNA抑制自噬可以上調(diào)CASP8及其剪切片段的表達，并上調(diào)Bid剪切片段及增加CASP9活性，表明通過藥物以及基因抑制自噬能通過活化CASP8-Bid信號通路增強IFN1@誘導(dǎo)的凋亡。
　　綜上所述，通過RNAi或氯喹抑制自噬增加了IFN1@在白血病中的抗腫瘤活性，CASP8依賴的凋亡信號通路可能是其中主要的作用機制。本研究通過證實自噬在白血病IFN1@耐藥中的作用及其機制，提出聯(lián)合自噬抑制劑可能減少IFN