慢性冷熱應(yīng)激對(duì)小鼠中性粒細(xì)胞抗腫瘤活性的影響.pdf

1、前言：
　　 機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系,腫瘤發(fā)生后,機(jī)體可通過免疫效應(yīng)機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。目前發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclearneutrophils,PMNs)參與抗腫瘤過程,中性粒細(xì)胞由趨化因子募集到達(dá)腫瘤部位,產(chǎn)生多種細(xì)胞毒性物質(zhì)如活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS),阮酶類,膜穿孔因子,可溶的細(xì)胞殺傷物質(zhì),包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白介素一1β(IL-1β),

2、干擾素(IFN)。它還通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Antibody-DependentCellCytotoxicity,ADCC)殺傷癌細(xì)胞。
　　 腫瘤熱療是指用各種方法提高全身和/或腫瘤組織(局部)的溫度,利用熱作用及其繼發(fā)效應(yīng)來治療惡性腫瘤。近年來全身熱療成為重要的腫瘤輔助性治療手段。全身熱療的溫度不超過42℃,可以誘發(fā)自然殺傷細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞免疫效應(yīng)的增強(qiáng),增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的功能,抑制原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長。溫

3、和全身熱療還能促使機(jī)體白細(xì)胞重新分布,提高中性粒細(xì)胞比例,促進(jìn)其移行和趨化作用;促進(jìn)淋巴細(xì)胞向二級(jí)淋巴器官移動(dòng),增強(qiáng)機(jī)體免疫監(jiān)視作用。
　　 大量研究表明,寒冷應(yīng)激可以對(duì)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生影響。一般而言,急性冷應(yīng)激常呈現(xiàn)免疫抑制,而慢性冷應(yīng)激常引起免疫增強(qiáng);溫和冷應(yīng)激常引起免疫增強(qiáng),過強(qiáng)冷應(yīng)激則可以引起機(jī)體免疫功能嚴(yán)重抑制,致使機(jī)體免疫機(jī)能下降。
　　 冷熱應(yīng)激能甭對(duì)中性粒細(xì)胞的生物學(xué)功能以及抗腫瘤活性產(chǎn)生影響

4、,目前尚不清楚,本研究塒此進(jìn)行了研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑
　　 雌性BALB/c小鼠,6-8w,SPF級(jí)。
　　 中性粒細(xì)胞分離液,弗波醇PMA,牡蠣糖原,ROS熒光染料DCFH-DA,CFSE,PI,RPMI1640培養(yǎng)液,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS),PBS粉末,含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶等。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
　　 雌性BALB/c小

5、鼠60只,正常小鼠30只和荷瘤鼠30只,各平均分為三組:23℃(對(duì)照)組,40℃(處理)組,4℃(處理)組。處理組小鼠分別放在40℃與4℃環(huán)境下2h/d,連續(xù)處理5d,每天觀察記錄荷瘤鼠腫瘤大小。
　　 3.樣品采集與指標(biāo)檢測(cè)
　　 (1)中性粒細(xì)胞分離及懸液制備
　　 腹腔注射小鼠1%牡蠣糖原1.5ml,4h后頸椎脫位處死小鼠,常規(guī)無菌腹腔灌洗收集腹腔液,中性粒細(xì)胞分離液分離純化,重懸得到中性粒細(xì)胞懸液,調(diào)整濃

6、度至1×106/ml。
　　 (2)中性粒細(xì)胞純度的檢測(cè)
　　 吸取20μl中性粒細(xì)胞懸液原液,經(jīng)涂片離心機(jī)離心,瑞士吉姆薩雙染鑒定中性粒細(xì)胞的純度在90%以上。
　　 (3)中性粒細(xì)胞活化產(chǎn)物ROS的檢測(cè)
　　 吸取中性粒細(xì)胞懸液300μl,加入300μ110μM的DCFH-DA,37℃孵育30min,取出后加入8μ110μM的PMA,進(jìn)行流式檢測(cè)。
　　 (4)中性粒細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能的檢測(cè)<

7、br>　　 將中性粒細(xì)胞懸液1×106/ml200μl/孔加入到5x104/ml200μl/孔的L929腫瘤細(xì)胞中,共同孵育24小時(shí),之后收集細(xì)胞,進(jìn)行流式檢測(cè)。
　　 (5)MethA腫瘤模型的建立
　　 MethA腫瘤細(xì)胞,調(diào)整濃度至2×107/ml,接種到BALB/c小鼠背部皮下0.1ml/只。5天后長出肉眼可見實(shí)體瘤,成瘤率為80%。
　　 (6)處理前后腫瘤體積的檢測(cè)
　　 處理前后用游標(biāo)卡尺

8、測(cè)量荷瘤鼠腫瘤K(a)短(b)徑,依公式腫瘤體積V=ab2/2計(jì)算出體積,比較均值。
　　 (7)腫瘤重量的檢測(cè)
　　 荷瘤鼠頸椎脫位處死,去除皮毛,剝離皮下腫瘤,稱重。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用spss16.0軟件分析結(jié)果,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差進(jìn)行比較。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.中性粒細(xì)胞純度的鑒定
　　 光學(xué)顯微鏡下,10個(gè)視野(400x)中性粒細(xì)胞所占

9、比例平均值為90%以上。
　　 2.冷熱處理對(duì)正常小鼠中性粒細(xì)胞活性氧ROS產(chǎn)生水平的影響
　　 冷熱處理對(duì)正下常小鼠中性粒細(xì)胞ROS的產(chǎn)生水平(MFI)的檢測(cè)結(jié)果為:40℃處理組中性粒細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(3189.73±425.30)顯著高于23℃組(296.76±72.00)(P＜0.001);4℃處理組中性粒細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(5830.37±94.78)顯著高于23℃組(296.76±72.00)(P＜0

10、.001);4℃處理組中性粒細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(5830.37±94.78)顯著高于40℃處理組(3189.73±425.30)(P＜0.001)。
　　 3.冷熱處理對(duì)正常小鼠中性粒細(xì)胞殺傷活性的影響
　　 冷熱處理對(duì)正常小鼠中性粒細(xì)胞殺傷率檢測(cè)結(jié)果為:40℃處理組中性粒細(xì)胞殺傷率(6.50±2.50%)明顯高于23℃組(1.70±0.89%)(P＜0.05);4℃處理組中性粒細(xì)胞殺傷率(10.00±2.00%)明

11、顯高于23℃組(1.70±0.89%)(P＜0.05);4℃處理組中性粒細(xì)胞殺傷率(10.00±2.00%)高于40℃處理組中性粒細(xì)胞殺傷率(6.50±2.50%),但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.冷熱處理對(duì)荷瘤鼠腫瘤體積的影晌
　　 冷熱處理對(duì)荷瘤鼠腫瘤體積的影響結(jié)果為:4℃處理組腫瘤體積均值在處理后(142.52±1.41cm3)低于處理前(207.57±26.71cm3),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);40℃處理組腫

12、瘤體積均值在處理后(143.95±33.77cm3)也低于處理前(185.72±20.97cm3),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而23℃組腫瘤體積均值在處理后(260.76±86.73cm3)高于處理前(215.39±54.94cm3)。
　　 5.冷熱處理對(duì)荷瘤鼠腫瘤重量的影響
　　 冷熱處理對(duì)荷瘤鼠腫瘤重量的影響結(jié)果為:荷瘤鼠40℃處理組腫瘤重量均值(70.27±17.15mg)明顯低于23℃組(116.304±14.36mg)

13、(P＜O.05);4℃處理組腫瘤重量均值(56.27±30.12mg)明顯低于23℃組(116.304±14.36mg)(P＜0.05)。
　　 6.冷熱處理對(duì)荷瘤鼠中性粒細(xì)胞ROS的影響
　　 冷熱處理對(duì)荷瘤鼠中性粒細(xì)胞活性氧ROS產(chǎn)生水平檢測(cè)結(jié)果為:40℃處理組中性粒細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(MFI)(1794.50±212.89)顯著高于23℃組(1132.83±179.47)(P＜0.001);4℃處理組中性粒細(xì)胞

14、ROS平均熒光強(qiáng)度(2019.97±235.46)顯著高于23℃組(1132.83±179.47)(P＜0.001);4℃處理組中性粒細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(2019.97±235.46)高于40℃處理組(1794.50±212.89),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7.冷熱處理對(duì)荷瘤鼠中性粒細(xì)胞殺傷活性的影響
　　 冷熱處理對(duì)荷瘤鼠中性粒細(xì)胞殺傷率的檢測(cè)結(jié)果為:40℃處理組中性粒細(xì)胞殺傷率(8.68±2.49%)明顯高于23

15、℃組(4.16±0.52%)(P＜0.05);4℃處理組中性粒細(xì)胞殺傷率(7.79±0.66%)明顯高于對(duì)照組(4.16±0.52%)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.慢性冷熱應(yīng)激能夠增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的抗腫瘤作用;
　　 2.慢性冷應(yīng)激(4℃)與慢性溫和熱應(yīng)激(40℃)對(duì)荷瘤鼠有一定治療作用;
　　 3.慢性冷應(yīng)激(4℃)對(duì)中性粒細(xì)胞活性氧ROS產(chǎn)生水平的影響明顯高于慢性溫和熱應(yīng)激(40℃);