牙周膜干細(xì)胞與中性粒細(xì)胞相互影響的研究.pdf

1、組織工程是一門近年來(lái)興起的前沿學(xué)科，通過(guò)再生出具有正常結(jié)構(gòu)和功能的組織或者器官達(dá)到治愈疾病、提高治療效果或改善生活質(zhì)量等目標(biāo)。牙周疾病的治療是口腔醫(yī)學(xué)的研究和工作中心之一，雖然牙周基礎(chǔ)治療、牙周手術(shù)都取得了良好的治療效果，但是牙周炎導(dǎo)致的骨缺損治療仍然是一個(gè)難題。近年來(lái)，關(guān)于組織工程和牙周膜干細(xì)胞的研究進(jìn)展給牙周組織生物再生帶來(lái)了新的希望。除了具有良好的生物學(xué)特性和組織再生功能之外，牙周膜干細(xì)胞還被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)能力。以往的研究

2、汪實(shí)，牙周膜干細(xì)胞不會(huì)引起同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖，能劑量依賴性地抑制絲裂原和抗原引起的T淋巴細(xì)胞增殖，能夠抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、分化和趨化。異體牙周膜干細(xì)胞可以成功地修復(fù)牙周炎骨缺損，且沒(méi)有細(xì)胞免疫和體液免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　機(jī)體的免疫包括固有免疫和適應(yīng)性免疫，適應(yīng)性免疫又可分為細(xì)胞免疫(T淋巴細(xì)胞主導(dǎo))和體液免疫（B淋巴細(xì)胞主導(dǎo)）。牙周膜干細(xì)胞能夠抑制細(xì)胞免疫與體液免疫，但是牙周膜干細(xì)胞對(duì)機(jī)體固有免疫的影響尚不清楚。中性粒

3、細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，在維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抵御病原體入侵方面發(fā)揮重要作用。牙周膜干細(xì)胞移植到體內(nèi)后，將不可避免地與中性粒細(xì)胞發(fā)生接觸，而牙周膜干細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的相互作用關(guān)系尚不明確。本研究擬探討牙周膜干細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的相互作用情況及其相關(guān)機(jī)制，為擴(kuò)大牙周組織再生種子細(xì)胞的來(lái)源、促進(jìn)牙周組織再生生物技術(shù)的發(fā)展、更安全地應(yīng)用牙周膜干細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分:牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和

4、鑒定
　　目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究人牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法:麻醉下無(wú)菌拔除人阻生第三磨牙或者正畸減數(shù)牙，輕輕剝離其周圍的牙周組織，取中段牙周組織，酶消化法分離牙周膜干細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況、探討牙周膜干細(xì)胞的骨向、脂肪向、軟骨向分化能力來(lái)研究牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性。結(jié)果:經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，牙周膜干細(xì)胞不表達(dá)造血譜系細(xì)胞的標(biāo)志物CD14，CD34和CD45，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的三個(gè)標(biāo)志物STRO-1，CD

5、90和CD146，表達(dá)率分別為:26.2％，96.3％，88.6％。在骨向、脂肪向、軟骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，牙周膜干細(xì)胞能夠骨向、脂肪向、軟骨向分化。PDLSCs在礦化液的誘導(dǎo)下，細(xì)胞增殖速度明顯減慢，細(xì)胞逐漸變成圓形、立方形、多角形，細(xì)胞融合逐漸形成單層，培養(yǎng)3周左右出現(xiàn)復(fù)層。骨向分化4周后，形成結(jié)節(jié)樣的結(jié)構(gòu)，Von-kossa染色呈現(xiàn)較多的棕褐色鈣質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域。在脂肪向誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，PDLSCs細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，細(xì)胞逐

6、漸失去原有的梭狀成纖維細(xì)胞樣而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭?xì)胞，細(xì)胞肥大、扁平，胞漿內(nèi)可見小脂滴積聚。脂肪向分化4周后，大多數(shù)細(xì)胞變成含有較多脂滴的脂肪細(xì)胞，油紅O染色可見細(xì)胞胞漿內(nèi)橙紅色陽(yáng)性顆粒，脂滴呈串珠狀、環(huán)狀。在軟骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，PDLSCs的細(xì)胞增殖速度顯著減弱，細(xì)胞呈明顯的聚集性生長(zhǎng)，形態(tài)由梭形逐漸向圓形、多邊形、多角形轉(zhuǎn)變，并帶有多個(gè)突起，10天后，有類似軟骨樣的結(jié)節(jié)形成，3周后，番紅O染色陽(yáng)性，表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)紅染、細(xì)胞內(nèi)紅色顆

7、粒、胞核褐色，Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈現(xiàn)較廣泛的陽(yáng)性黃褐色染色，鏡下可見胞漿富含棕色顆粒的類軟骨細(xì)胞。結(jié)論:通過(guò)酶消化法能較好地分離牙周膜干細(xì)胞;牙周膜干細(xì)胞不表達(dá)造血系細(xì)胞標(biāo)記物CD14、CD34、CD45，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的3個(gè)標(biāo)志物STRO-1、CD90、CD146;牙周膜干細(xì)胞能夠骨向、脂肪向、軟骨向分化。
　　第二部分:牙周膜干細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞生理功能影響的研究
　　目的:研究人牙周膜干細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞活力、

8、凋亡、粘附分子表達(dá)、吞噬功能、趨化功能等的影響。方法:分離、培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。在細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸培養(yǎng)／Transwell培養(yǎng)、不同牙周膜干細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量比的情況下，將牙周膜干細(xì)胞和異體中性粒細(xì)胞共同培養(yǎng)，然后提取中性粒細(xì)胞，檢測(cè)其細(xì)胞活力、凋亡情況、粘附分子表達(dá)、吞噬功能、趨化功能;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)共培養(yǎng)24小時(shí)的牙周膜干細(xì)胞+等量中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的濃度;將中性粒細(xì)胞與不同濃度的IL-6共培養(yǎng)，

9、檢測(cè)中性粒細(xì)胞的凋亡情況;進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，在牙周膜干細(xì)胞+中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入抗IL-6抗體，觀察中性粒細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:牙周膜干細(xì)胞能促使靜止期中性粒細(xì)胞和IL-8活化中性粒細(xì)胞的活力明顯增高;隨著牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的增多，其促進(jìn)中性粒細(xì)胞活力的能力并沒(méi)有升高;牙周膜干細(xì)胞促進(jìn)IL-8活化中性粒細(xì)胞活力的能力與其對(duì)靜止期中性粒細(xì)胞的作用無(wú)顯著差異;牙周膜干細(xì)胞能夠減少靜止期中性粒細(xì)胞和IL-8活化中性粒細(xì)胞的凋亡，且牙周膜干

10、細(xì)胞減少兩種中性粒細(xì)胞的凋亡程度基本相當(dāng)，無(wú)明顯差異;無(wú)論牙周膜干細(xì)胞與中性粒細(xì)胞直接接觸培養(yǎng)還是Transwell培養(yǎng)，牙周膜干細(xì)胞都能夠減少中性粒細(xì)胞的凋亡，且兩種培養(yǎng)方式中牙周膜干細(xì)胞減少中性粒細(xì)胞凋亡的程度相近，提示PDLSCs的抑制中性粒細(xì)胞凋亡作用并不是必須依賴細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸的，而可能是通過(guò)分泌可溶性因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的;單純中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6濃度較低，而在牙周膜干細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)后，IL-6濃度明

11、顯升高;IL-6能抑制中性粒細(xì)胞凋亡;抗IL-6抗體能抵消牙周膜干細(xì)胞介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞凋亡抑制;牙周膜干細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞粘附分子的表達(dá)情況無(wú)影響;牙周膜干細(xì)胞不影響中性粒細(xì)胞的吞噬功能和趨化功能。結(jié)論:牙周膜干細(xì)胞能促進(jìn)靜止期中性粒細(xì)胞和IL-8活化中性粒細(xì)胞的活力、減少其凋亡率;牙周膜干細(xì)胞抑制中性粒細(xì)胞凋亡的作用并不是依賴細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸，而可能是通過(guò)分泌可溶性因子IL-6來(lái)實(shí)現(xiàn)的;牙周膜干細(xì)胞不影響中性粒細(xì)胞粘附分子的表達(dá)、吞噬

12、功能和趨化功能。
　　第三部分:中性粒細(xì)胞對(duì)牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究
　　目的:研究中性粒細(xì)胞對(duì)牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法:麻醉下無(wú)菌拔除人阻生第三磨牙或者正畸減數(shù)牙，輕輕剝離其周圍的牙周組織，取中段牙周組織，酶消化法分離并培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞。將生長(zhǎng)密度達(dá)80％左右的牙周膜干細(xì)胞消化，以5.0×104細(xì)胞鋪板，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后與等量異體中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，

13、提取牙周膜干細(xì)胞，然后分別檢測(cè)以下指標(biāo):克隆形成率、細(xì)胞增殖率、骨向和脂肪向誘導(dǎo)分化、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況、超微結(jié)構(gòu)觀察、染色體核型分析等。結(jié)果:無(wú)論是單獨(dú)培養(yǎng)的PDLSCs，還是與等量異體中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后的PDLSCs，細(xì)胞呈梭狀的成纖維細(xì)胞樣，形態(tài)規(guī)則、均一，兩者的形態(tài)未見明顯區(qū)別。單獨(dú)培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞的克隆形成率為28/5.0×103細(xì)胞，明顯高于與等量異體中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)牙周膜干細(xì)胞的克隆形成率（19/

14、5.0×103細(xì)胞），兩者之間有顯著性差異。單獨(dú)培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞的Brdu陽(yáng)性率為71％±11.2％，明顯高于與等量異體中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)牙周膜干細(xì)胞的Brdu陽(yáng)性率(47％±9.1％)，兩者之間有顯著性差異。兩組細(xì)胞都可以骨向和脂肪向分化:骨向分化后，RT-PCR發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞都有骨鈣素的表達(dá);脂肪向分化后，RT-PCR發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞都有PPAR-γ2、LPL的表達(dá)。兩組細(xì)胞都表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物STRO-1，CD90和CD14

15、6，表達(dá)率分別為:29.6％，98.8％，89.5％，與單獨(dú)培養(yǎng)PDLSCs的表達(dá)率無(wú)顯著性差異。兩組細(xì)胞的電鏡觀察結(jié)果相近，在掃描電鏡下，無(wú)論單獨(dú)培養(yǎng)PDLSCs還是與等量異體中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)的PDLSCs都有較多長(zhǎng)短不一的分支，細(xì)胞周圍有分泌的細(xì)胞外基質(zhì)。在透射電鏡下兩種細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞核形態(tài)欠規(guī)則，核仁較大，核內(nèi)染色質(zhì)豐富。胞漿細(xì)胞器豐富，可見豐富的蛋白顆粒、高爾基囊泡、游離核糖小體等。兩組細(xì)胞的染色體核型檢查相同。結(jié)論