牙周膜干細胞與中性粒細胞相互影響的研究.pdf

1、組織工程是一門近年來興起的前沿學(xué)科，通過再生出具有正常結(jié)構(gòu)和功能的組織或者器官達到治愈疾病、提高治療效果或改善生活質(zhì)量等目標(biāo)。牙周疾病的治療是口腔醫(yī)學(xué)的研究和工作中心之一，雖然牙周基礎(chǔ)治療、牙周手術(shù)都取得了良好的治療效果，但是牙周炎導(dǎo)致的骨缺損治療仍然是一個難題。近年來，關(guān)于組織工程和牙周膜干細胞的研究進展給牙周組織生物再生帶來了新的希望。除了具有良好的生物學(xué)特性和組織再生功能之外，牙周膜干細胞還被發(fā)現(xiàn)具有強大的免疫調(diào)節(jié)能力。以往的研究

2、汪實，牙周膜干細胞不會引起同種異體T淋巴細胞的增殖，能劑量依賴性地抑制絲裂原和抗原引起的T淋巴細胞增殖，能夠抑制B淋巴細胞的增殖、分化和趨化。異體牙周膜干細胞可以成功地修復(fù)牙周炎骨缺損，且沒有細胞免疫和體液免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　機體的免疫包括固有免疫和適應(yīng)性免疫，適應(yīng)性免疫又可分為細胞免疫(T淋巴細胞主導(dǎo))和體液免疫（B淋巴細胞主導(dǎo)）。牙周膜干細胞能夠抑制細胞免疫與體液免疫，但是牙周膜干細胞對機體固有免疫的影響尚不清楚。中性粒

3、細胞是機體固有免疫的重要組成部分，在維持機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抵御病原體入侵方面發(fā)揮重要作用。牙周膜干細胞移植到體內(nèi)后，將不可避免地與中性粒細胞發(fā)生接觸，而牙周膜干細胞與中性粒細胞的相互作用關(guān)系尚不明確。本研究擬探討牙周膜干細胞和中性粒細胞的相互作用情況及其相關(guān)機制，為擴大牙周組織再生種子細胞的來源、促進牙周組織再生生物技術(shù)的發(fā)展、更安全地應(yīng)用牙周膜干細胞提供實驗依據(jù)。本研究包括以下三個部分:
　　第一部分:牙周膜干細胞的分離、培養(yǎng)和

4、鑒定
　　目的:通過體外實驗研究人牙周膜干細胞的生物學(xué)特性。方法:麻醉下無菌拔除人阻生第三磨牙或者正畸減數(shù)牙，輕輕剝離其周圍的牙周組織，取中段牙周組織，酶消化法分離牙周膜干細胞，通過檢測間充質(zhì)干細胞標(biāo)志物的表達情況、探討牙周膜干細胞的骨向、脂肪向、軟骨向分化能力來研究牙周膜干細胞的生物學(xué)特性。結(jié)果:經(jīng)過流式細胞術(shù)檢測，牙周膜干細胞不表達造血譜系細胞的標(biāo)志物CD14，CD34和CD45，表達間充質(zhì)干細胞的三個標(biāo)志物STRO-1，CD

5、90和CD146，表達率分別為:26.2％，96.3％，88.6％。在骨向、脂肪向、軟骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，牙周膜干細胞能夠骨向、脂肪向、軟骨向分化。PDLSCs在礦化液的誘導(dǎo)下，細胞增殖速度明顯減慢，細胞逐漸變成圓形、立方形、多角形，細胞融合逐漸形成單層，培養(yǎng)3周左右出現(xiàn)復(fù)層。骨向分化4周后，形成結(jié)節(jié)樣的結(jié)構(gòu)，Von-kossa染色呈現(xiàn)較多的棕褐色鈣質(zhì)陽性反應(yīng)區(qū)域。在脂肪向誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，PDLSCs細胞生長速度明顯減慢，細胞逐

6、漸失去原有的梭狀成纖維細胞樣而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭毎?，細胞肥大、扁平，胞漿內(nèi)可見小脂滴積聚。脂肪向分化4周后，大多數(shù)細胞變成含有較多脂滴的脂肪細胞，油紅O染色可見細胞胞漿內(nèi)橙紅色陽性顆粒，脂滴呈串珠狀、環(huán)狀。在軟骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，PDLSCs的細胞增殖速度顯著減弱，細胞呈明顯的聚集性生長，形態(tài)由梭形逐漸向圓形、多邊形、多角形轉(zhuǎn)變，并帶有多個突起，10天后，有類似軟骨樣的結(jié)節(jié)形成，3周后，番紅O染色陽性，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)紅染、細胞內(nèi)紅色顆

7、粒、胞核褐色，Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學(xué)染色呈現(xiàn)較廣泛的陽性黃褐色染色，鏡下可見胞漿富含棕色顆粒的類軟骨細胞。結(jié)論:通過酶消化法能較好地分離牙周膜干細胞;牙周膜干細胞不表達造血系細胞標(biāo)記物CD14、CD34、CD45，表達間充質(zhì)干細胞的3個標(biāo)志物STRO-1、CD90、CD146;牙周膜干細胞能夠骨向、脂肪向、軟骨向分化。
　　第二部分:牙周膜干細胞對中性粒細胞生理功能影響的研究
　　目的:研究人牙周膜干細胞對中性粒細胞活力、

8、凋亡、粘附分子表達、吞噬功能、趨化功能等的影響。方法:分離、培養(yǎng)牙周膜干細胞和中性粒細胞。在細胞-細胞直接接觸培養(yǎng)／Transwell培養(yǎng)、不同牙周膜干細胞和中性粒細胞數(shù)量比的情況下，將牙周膜干細胞和異體中性粒細胞共同培養(yǎng)，然后提取中性粒細胞，檢測其細胞活力、凋亡情況、粘附分子表達、吞噬功能、趨化功能;應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測共培養(yǎng)24小時的牙周膜干細胞+等量中性粒細胞培養(yǎng)上清中IL-6的濃度;將中性粒細胞與不同濃度的IL-6共培養(yǎng)，

9、檢測中性粒細胞的凋亡情況;進行中和實驗，在牙周膜干細胞+中性粒細胞的培養(yǎng)體系中加入抗IL-6抗體，觀察中性粒細胞的凋亡情況。結(jié)果:牙周膜干細胞能促使靜止期中性粒細胞和IL-8活化中性粒細胞的活力明顯增高;隨著牙周膜干細胞細胞數(shù)量的增多，其促進中性粒細胞活力的能力并沒有升高;牙周膜干細胞促進IL-8活化中性粒細胞活力的能力與其對靜止期中性粒細胞的作用無顯著差異;牙周膜干細胞能夠減少靜止期中性粒細胞和IL-8活化中性粒細胞的凋亡，且牙周膜干

10、細胞減少兩種中性粒細胞的凋亡程度基本相當(dāng)，無明顯差異;無論牙周膜干細胞與中性粒細胞直接接觸培養(yǎng)還是Transwell培養(yǎng)，牙周膜干細胞都能夠減少中性粒細胞的凋亡，且兩種培養(yǎng)方式中牙周膜干細胞減少中性粒細胞凋亡的程度相近，提示PDLSCs的抑制中性粒細胞凋亡作用并不是必須依賴細胞-細胞直接接觸的，而可能是通過分泌可溶性因子來實現(xiàn)的;單純中性粒細胞培養(yǎng)上清液中的IL-6濃度較低，而在牙周膜干細胞與中性粒細胞共同培養(yǎng)24小時后，IL-6濃度明

11、顯升高;IL-6能抑制中性粒細胞凋亡;抗IL-6抗體能抵消牙周膜干細胞介導(dǎo)的中性粒細胞凋亡抑制;牙周膜干細胞對中性粒細胞粘附分子的表達情況無影響;牙周膜干細胞不影響中性粒細胞的吞噬功能和趨化功能。結(jié)論:牙周膜干細胞能促進靜止期中性粒細胞和IL-8活化中性粒細胞的活力、減少其凋亡率;牙周膜干細胞抑制中性粒細胞凋亡的作用并不是依賴細胞-細胞直接接觸，而可能是通過分泌可溶性因子IL-6來實現(xiàn)的;牙周膜干細胞不影響中性粒細胞粘附分子的表達、吞噬

12、功能和趨化功能。
　　第三部分:中性粒細胞對牙周膜干細胞生物學(xué)特性影響的研究
　　目的:研究中性粒細胞對牙周膜干細胞生物學(xué)特性的影響。方法:麻醉下無菌拔除人阻生第三磨牙或者正畸減數(shù)牙，輕輕剝離其周圍的牙周組織，取中段牙周組織，酶消化法分離并培養(yǎng)牙周膜干細胞。將生長密度達80％左右的牙周膜干細胞消化，以5.0×104細胞鋪板，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2小時，使細胞貼壁。然后與等量異體中性粒細胞共培養(yǎng)24小時。24小時后，

13、提取牙周膜干細胞，然后分別檢測以下指標(biāo):克隆形成率、細胞增殖率、骨向和脂肪向誘導(dǎo)分化、間充質(zhì)干細胞標(biāo)志物的表達情況、超微結(jié)構(gòu)觀察、染色體核型分析等。結(jié)果:無論是單獨培養(yǎng)的PDLSCs，還是與等量異體中性粒細胞共培養(yǎng)24小時后的PDLSCs，細胞呈梭狀的成纖維細胞樣，形態(tài)規(guī)則、均一，兩者的形態(tài)未見明顯區(qū)別。單獨培養(yǎng)牙周膜干細胞的克隆形成率為28/5.0×103細胞，明顯高于與等量異體中性粒細胞共培養(yǎng)24小時牙周膜干細胞的克隆形成率（19/

14、5.0×103細胞），兩者之間有顯著性差異。單獨培養(yǎng)牙周膜干細胞的Brdu陽性率為71％±11.2％，明顯高于與等量異體中性粒細胞共培養(yǎng)24小時牙周膜干細胞的Brdu陽性率(47％±9.1％)，兩者之間有顯著性差異。兩組細胞都可以骨向和脂肪向分化:骨向分化后，RT-PCR發(fā)現(xiàn)兩組細胞都有骨鈣素的表達;脂肪向分化后，RT-PCR發(fā)現(xiàn)兩組細胞都有PPAR-γ2、LPL的表達。兩組細胞都表達間充質(zhì)干細胞的標(biāo)志物STRO-1，CD90和CD14

15、6，表達率分別為:29.6％，98.8％，89.5％，與單獨培養(yǎng)PDLSCs的表達率無顯著性差異。兩組細胞的電鏡觀察結(jié)果相近，在掃描電鏡下，無論單獨培養(yǎng)PDLSCs還是與等量異體中性粒細胞共培養(yǎng)24小時的PDLSCs都有較多長短不一的分支，細胞周圍有分泌的細胞外基質(zhì)。在透射電鏡下兩種細胞生長旺盛，細胞核形態(tài)欠規(guī)則，核仁較大，核內(nèi)染色質(zhì)豐富。胞漿細胞器豐富，可見豐富的蛋白顆粒、高爾基囊泡、游離核糖小體等。兩組細胞的染色體核型檢查相同。結(jié)論