異體牙周膜干細(xì)胞移植與機(jī)體體液(B細(xì)胞)免疫應(yīng)答研究.pdf

1、牙齒缺失修復(fù)及牙周組織再生是口腔科學(xué)的工作和研究中心之一，目前臨床上對牙周炎致骨缺損的治療仍然是一個難題，而利用義齒包括固定義齒、活動義齒和種植義齒等修復(fù)是一類贗復(fù)體修復(fù)，缺乏真正意義上的生物修復(fù)。近年來，關(guān)于牙齒干細(xì)胞及組織工程技術(shù)的研究進(jìn)展給牙齒和牙周組織生物再生帶來了新的希望。諸多研究提示牙齒相關(guān)干細(xì)胞是牙齒再生和牙周組織再生的最佳種子細(xì)胞來源，具有較廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，自體牙齒干細(xì)胞來源有限，如果牙齒干細(xì)胞能異體應(yīng)用，就能

2、明顯擴(kuò)大牙齒再生種子細(xì)胞來源，極大推進(jìn)牙齒和牙周組織再生的發(fā)展。機(jī)體的免疫分為細(xì)胞免疫和體液免疫兩部分，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)牙齒相關(guān)干細(xì)胞不會引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是牙齒相關(guān)干細(xì)胞對機(jī)體體液免疫應(yīng)答（B淋巴細(xì)胞）的影響尚不清楚。為了同種異體牙周膜干細(xì)胞能夠?qū)戆踩赜糜谂R床，本研究擬探討牙周膜干細(xì)胞對同種異體B淋巴細(xì)胞功能的影響，并利用小型豬模型，觀察牙周膜干細(xì)胞異體移植修復(fù)牙周炎骨缺損的能力及有無體液免疫排斥。本研究包括以下三個部分:

3、
　　第一部人牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　目的:分離培養(yǎng)及鑒定人牙周膜干細(xì)胞，為下一步對牙周膜干細(xì)胞的其他性能進(jìn)行研究提供必要的基礎(chǔ)和前提。方法:選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診拔除阻生第三磨牙的患者，無菌條件下剝離牙根外牙周組織，參照以往關(guān)于人牙齒相關(guān)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及條件，分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞，并通過倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀等對其生長特性、誘導(dǎo)分化能力，表面標(biāo)志物進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的人

4、牙周膜干細(xì)胞生長良好，呈梭性。牙周膜干細(xì)胞的克隆形成率為（15-28個/105）。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞中的STRO-1，CD146，CD90，SSEA-4，OCT-4，其表達(dá)陽性率分別為13.34±1.83％，80.61％±5.41％，98.67％±1.03％，88.67％±4.03％，95.33％±4.53％。經(jīng)誘導(dǎo)分化后，牙周膜干細(xì)胞在體外有誘導(dǎo)分化成骨和成脂肪的能力。
　　結(jié)論:人牙周膜干細(xì)胞可在體外成

5、功培養(yǎng)，表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，并有橫向分化的潛能。
　　第二部分人牙周膜干細(xì)胞對同種異體B淋巴細(xì)胞的影響
　　目的:在體外研究人牙周膜干細(xì)胞對同種異體B淋巴細(xì)胞功能的影響。
　　方法:正常人外周血的B淋巴細(xì)胞與人牙周膜干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過對B淋巴細(xì)胞增殖、凋亡、分化、趨化、分泌功能和共刺激分子表達(dá)的檢測，從而研究牙周膜干細(xì)胞對B淋巴細(xì)胞功能的影響，同時用hBMSCs作同型對照，并通過Transwell實驗，CBA、抗體中

6、和實驗等來研究牙周膜干細(xì)胞影響B(tài)淋巴細(xì)胞增殖和凋亡的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，牙周膜干細(xì)胞抑制由CpG ODN、rCD40L、Anti-immunoglobulin(IgA+IgG+IgM)、IL-2和IL-4引起的B淋巴細(xì)胞增殖，且這種抑制具有濃度依賴性;延遲加入牙周膜干細(xì)胞也能抑制由上述刺激所引起的B淋巴細(xì)胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，牙周膜干細(xì)胞對B淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子(CD40、CD80、CD86和HLA DR)

7、的表達(dá)和分泌功能不產(chǎn)生影響，但對B淋巴細(xì)胞的分化和趨化功能有抑制作用。通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn):牙周膜干細(xì)胞抑制B淋巴細(xì)胞增殖的機(jī)制可能是通過細(xì)胞接觸和可溶性分子共同作用。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):共培養(yǎng)后，牙周膜干細(xì)胞表面PD-1、PD-L1和PD-L2表達(dá)發(fā)生改變;進(jìn)一步利用抗體中和實驗證明，牙周膜干細(xì)胞可能是通過PD-1和PD-L1來部分抑制B淋巴細(xì)胞增殖。凋亡實驗表明，牙周膜干細(xì)胞并非通過促進(jìn)B淋巴細(xì)胞凋亡來發(fā)揮免疫抑制作用

8、，相反，牙周膜干細(xì)胞通過分泌IL-6抑制B淋巴細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論: hPDLSCs和hBMSCs類似，能夠抑制B淋巴細(xì)胞的增殖，而且這種抑制作用呈濃度依賴性;hPDLSCs對B細(xì)胞的分化、趨化功能也有抑制作用，但對B細(xì)胞的抗原提呈功能和分泌功能無明顯影響:hPDLSCs通過分泌IL-6抑制B淋巴細(xì)胞的凋亡;hPDLSCs通過PD-1及PD-L1部分抑制B淋巴細(xì)胞的增殖，與B淋巴細(xì)胞的凋亡無關(guān)。
　　第三部分小型豬牙周膜干

9、細(xì)胞同種異體移植后對機(jī)體體液免疫應(yīng)答的影響
　　目的:在體內(nèi)研究牙周膜干細(xì)胞的異體移植后對機(jī)體體液免疫應(yīng)答的影響。
　　方法:選用雌性五指山小型豬12只，建立牙周炎骨缺損模型，同時分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增五指山小型豬和雄性貴州小型香豬牙周膜干細(xì)胞。建模后1個月開始治療，分為4組:(1)空白對照組:建立實驗性牙周炎模型后不做任何處理;(2) HA/TCP組:在建模后做翻瓣刮治+ HA/TCP修復(fù)，覆蓋以明膠海綿;(3)自體牙周膜干細(xì)胞

10、+HA/TCP組:建模后做翻瓣刮治+自體牙周膜干細(xì)胞+ HA/TCP修復(fù)，覆蓋以明膠海綿;(4)異體牙周膜干細(xì)胞+ HA/TCP組:建模后做翻瓣刮治+雄性貴州小型香豬牙周膜干細(xì)胞+ HA/TCP修復(fù)，覆蓋以明膠海綿。觀察指標(biāo)包括臨床觀察（牙周探診深度、附著喪失等）、影像學(xué)檢查、血液學(xué)檢查、組織學(xué)觀察和體液免疫指標(biāo)等的檢測。
　　結(jié)果:成功建立牙周炎模型，各組模型之間無統(tǒng)計學(xué)差異;治療后12周，發(fā)現(xiàn)自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)

11、胞組的牙周指數(shù)（牙齦退縮、牙槽骨缺失和牙周袋深度）與空白對照組、HA/TCP組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，但治療后自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)胞組牙周指數(shù)之間無統(tǒng)計學(xué)意義。CT掃描發(fā)現(xiàn)，治療后12周，自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)胞組都有明顯的新生骨質(zhì)影像，而空白對照組和HA/TCP組卻不明顯。血液學(xué)研究表明，無論是治療前還是治療后各個時間點，各治療組的血常規(guī)、血生化、免疫球蛋白和體液免疫學(xué)指標(biāo)(CD20，CD25，B220)都沒有統(tǒng)計

12、學(xué)差異，同時檢測齦溝液和牙周組織的免疫球蛋白也沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明異體干細(xì)胞移植組在治療后無炎性病變產(chǎn)生，無肝腎功能的損傷，無近期或者遠(yuǎn)期體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生。組織學(xué)觀察表明，在自體牙周膜干細(xì)胞組和異體牙周膜干細(xì)胞組，都有明顯的牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜再生，骨缺損基本修復(fù)，而在空白對照組和HA/TCP組，仍可見明顯的典型牙周炎表現(xiàn)，包括深牙周袋、缺乏新骨和新牙周膜形成。最后通過細(xì)胞移植術(shù)后1周和2周，對自體移植組和異體移植組的局部牙周組織IL