神經(jīng)上皮干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)中相互影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 雪旺細(xì)胞(Schwann cell，SCs)是周?chē)窠?jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，神經(jīng)損傷后它對(duì)神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)起著重要的作用，是比較公認(rèn)的種子細(xì)胞。然而SCs存在不足，如：自體來(lái)源的SCs在適當(dāng)條件下難以獲得大量的雪旺細(xì)胞，多次傳代后其形態(tài)和功能改變，且需二次手術(shù)；而異體來(lái)源的SCs則存在免疫排斥反應(yīng)等，因此有必要繼續(xù)尋找更為有效的種子細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞移植入缺損的周?chē)窠?jīng)后能夠向雪旺細(xì)胞分化，改善神經(jīng)再生的微環(huán)境，促進(jìn)周

2、圍神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，而神經(jīng)干細(xì)胞分化形成神經(jīng)元并發(fā)出軸突支配受損神經(jīng)的靶器官能防止靶器官萎縮，揭示了神經(jīng)干細(xì)胞在修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷的廣闊前景。神經(jīng)上皮干細(xì)胞是較原始的神經(jīng)干細(xì)胞，有巨大的神經(jīng)元方向分化潛能，更適合修復(fù)損傷的神經(jīng)通路。關(guān)于雪旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞存活分化的影響已有初步研究，但雪旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)上皮干細(xì)胞的影響以及雪旺細(xì)胞與神經(jīng)上皮干細(xì)胞之間相互影響的結(jié)果鮮有報(bào)道。 目的： 周?chē)窠?jīng)損傷后的再生修復(fù)問(wèn)題一直是創(chuàng)傷外科

3、和神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的問(wèn)題。雪旺細(xì)胞作為首選的種子細(xì)胞在應(yīng)用上存在不足而受到限制。而神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷存在巨大的潛能，分化成特定的神經(jīng)細(xì)胞以及類(lèi)雪旺細(xì)胞樣細(xì)胞后分泌細(xì)胞因子以及其他一些不明機(jī)制均促進(jìn)神經(jīng)再生。所以探索如何為損傷的周?chē)窠?jīng)提供有利的環(huán)境，如何獲得足夠量的雪旺細(xì)胞，如何促進(jìn)NSC的存活和增加向SCs或神經(jīng)元分化的數(shù)量，促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生和功能恢復(fù)，以期為有效修復(fù)周?chē)窠?jīng)功能提供依據(jù)。在上述思想指導(dǎo)下，我們?cè)O(shè)計(jì)了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用

4、神經(jīng)上干細(xì)胞與雪旺細(xì)胞體外共培養(yǎng)的方法，觀察神經(jīng)上皮干細(xì)胞存活、定向分化、雪旺細(xì)胞增殖及MBP表達(dá)的情況，旨在探求體外培養(yǎng)同時(shí)獲得足夠量雪旺細(xì)胞和較多神經(jīng)元的最佳條件，為細(xì)胞移植修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 本課題從新生Wistar大鼠坐骨神經(jīng)及臂叢神經(jīng)分離雪旺細(xì)胞，用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于5﹪CO<,2>、37°C、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、純化，備用；從孕11.5d Wistar大鼠的胚胎神經(jīng)

5、管分離神經(jīng)上皮干細(xì)胞，用含10ng/mlbFGF和1xB27的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。通過(guò)雪旺細(xì)胞與神經(jīng)上皮干細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別為無(wú)血清的DMEM/F12(1：1)，1﹪血清的DMEM/F12(1：1)，5﹪血清的．DMEM/F12(1：1)，10﹪血清的DMEM/F12(1：1)，每2d更換新鮮培養(yǎng)液，并分別將收集更換的上清液過(guò)濾作為條件培養(yǎng)液，-70℃保存。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液分別為收集到的0、1、5、10﹪血清條件培養(yǎng)

6、液；對(duì)照組為0、1、5、10﹪血清DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)液。 1．定時(shí)于倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，并用顯微攝像系統(tǒng)采集圖像記錄。 2．實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)上皮干細(xì)胞接種于置有預(yù)涂多聚賴(lài)氨酸的蓋玻片的24孔板中，不同血清濃度的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3d換液，培養(yǎng)1周；對(duì)照組將神經(jīng)上皮干細(xì)胞接種于預(yù)涂多聚賴(lài)氨酸的蓋玻片上，用DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)1周；取出蓋玻片，固定，MAP-2、GFAP免疫熒光染色。每組選取4張蓋

7、玻片，每片隨機(jī)取5個(gè)不同的視野，IPP圖像分析軟件計(jì)數(shù)同一視野中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析各組神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例。 3．雪旺細(xì)胞以10<'5>個(gè)/ml接種于多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的96孔板中，每孔100ul，各組分別設(shè)8個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)3d，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)15μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸掉上清，用DMSO溶解結(jié)晶。然后將培養(yǎng)板放在Multiskan MK3酶標(biāo)儀上，采用實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，測(cè)定每孔OD值。

8、 4．雪旺細(xì)胞與神經(jīng)上皮干細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)4周后提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)SDS—PAGE及Western-blot檢測(cè)MBP表達(dá)情況；對(duì)照組為單獨(dú)培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，陽(yáng)性對(duì)照為成熟的周?chē)窠?jīng)組織。部分標(biāo)本細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)雪旺細(xì)胞MBP的表達(dá)。 結(jié)果： 1．神經(jīng)上皮干細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，并分裂增殖形成由十幾個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)球，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)球中細(xì)胞數(shù)目不斷增加，第5～6d可生長(zhǎng)成大約幾十個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)球。免疫細(xì)胞化學(xué)染色：球體n

9、estin染色陽(yáng)性，球周?chē)蠱AP2、GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞。 剛接種的原代Schwann細(xì)胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中，接種后6h大部分細(xì)胞貼壁，其中大部分細(xì)胞開(kāi)始呈橢圓形，24h后變成雙極，胞體飽滿，立體感強(qiáng)，少數(shù)呈三角形，伸出三個(gè)突起。培養(yǎng)48～72h后，出現(xiàn)聚合現(xiàn)象，許多細(xì)胞聚合在一起呈端對(duì)端、肩并肩、漩渦狀或柵欄狀排列，在細(xì)胞密度較低時(shí)，則聚集成堆，形成"細(xì)胞島"，免疫細(xì)胞化學(xué)染色為S-100陽(yáng)性；另一種細(xì)胞稍大，外形不規(guī)則

10、，呈扁平狀，突起短而多，核較淺，為成纖維細(xì)胞，所占比例較低。 實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)球貼壁較快，培養(yǎng)24h可見(jiàn)大部分神經(jīng)球貼壁，培養(yǎng)36h可見(jiàn)自神經(jīng)球遷出細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)大多圓形，胞體較飽滿，突起細(xì)長(zhǎng)的神經(jīng)元可見(jiàn)二三級(jí)突起，大體形態(tài)與成熟神經(jīng)元相似。神經(jīng)球周?chē)屑?xì)短突起伸出，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，突起束狀排列，雪旺細(xì)胞早期形態(tài)無(wú)明顯變化，隨著神經(jīng)球中遷出的細(xì)胞增多，明場(chǎng)下可觀察到在神經(jīng)元的軸突局部呈雙軌樣結(jié)構(gòu)，也有少數(shù)多個(gè)突起的細(xì)胞胞體呈不規(guī)則

11、型。對(duì)照組中的神經(jīng)球較少貼壁，且貼壁后的神經(jīng)球周?chē)w出的細(xì)胞極少，生長(zhǎng)狀況較差，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)神經(jīng)球貼壁不牢，其周?chē)募?xì)胞也逐漸減少，至培養(yǎng)1周，幾乎無(wú)貼壁的神經(jīng)球和細(xì)胞。 2.通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色和圖像分析觀察到實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞比例為1.53：1，神經(jīng)元形態(tài)成熟。隨著血清濃度增加，神經(jīng)元比逐漸降低。 3.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中隨血清濃度提高，雪旺細(xì)胞存活及增殖率顯著增加；0﹪血清實(shí)驗(yàn)組較0﹪血

12、清對(duì)照組更能促進(jìn)雪旺細(xì)胞存活和增殖，而其余血清濃度對(duì)照組促存活增殖效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)。 4.細(xì)胞免疫化學(xué)顯示MBP：部分軸突局部出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)MBP，表明雪旺細(xì)胞能夠在神經(jīng)上皮干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)元的誘導(dǎo)下向成髓鞘雪旺細(xì)胞方向分化5.Westernb-lot顯示：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)，聯(lián)合培養(yǎng)的細(xì)胞裂解后的上清液中有MBP存在，成熟的神經(jīng)組織中MBP含量較多。 結(jié)論： 聯(lián)合培養(yǎng)既有利于神經(jīng)上皮干