神經(jīng)干細(xì)胞和新生大鼠Corti氏器組織聯(lián)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前治療重度感音神經(jīng)性耳聾的主要方法還是人工耳蝸植入。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的完整性是人工耳蝸植入的前提并直接關(guān)系著植入后的臨床效果。對(duì)于重度感音神經(jīng)性耳聾的患者，不管導(dǎo)致疾病的誘因?yàn)楹?，一般都有不同程度的?nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的損傷或退化，所以如何恢復(fù)內(nèi)耳螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的完整性為耳科學(xué)的一大挑戰(zhàn)。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)具有良好的組織相容性和多向分化潛能，在胚胎和成年嚙齒類動(dòng)物中廣泛存在。神經(jīng)干細(xì)胞不僅可分化為

2、神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，而且，體內(nèi)移植后對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病均有一定的修復(fù)作用。研究表明，控制神經(jīng)干細(xì)胞不斷增殖和分化的因素十分復(fù)雜，常是多種因素共同作用的結(jié)果。如何能使神經(jīng)干細(xì)胞向特定的細(xì)胞分化，仍是目前研究的熱點(diǎn)。我們根據(jù)神經(jīng)干細(xì)胞多潛能分化的生物學(xué)特征，提出了是否可以在體外模擬內(nèi)耳的環(huán)境來誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的設(shè)想。本課題通過神經(jīng)干細(xì)胞和新生一天SD大鼠的Corti氏器組織聯(lián)合培養(yǎng)來定向誘導(dǎo)分

3、化神經(jīng)干細(xì)胞向螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，以期為臨床治療重度感音神經(jīng)性耳聾提供新的思路。 第一部分胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)118的體外培養(yǎng)和分化的研究 目的:探討神經(jīng)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法、增殖特點(diǎn)和多向分化的特性。 方法:取孕12天SD大鼠的海馬組織，采用機(jī)械分離的方法獲得神經(jīng)干細(xì)胞，并應(yīng)用無血清神經(jīng)元限定性培養(yǎng)基進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行單克隆純化，然后進(jìn)行Nestin(巢蛋白)免疫組織化學(xué)鑒定；將獲得的

4、神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行體外分化，對(duì)分化結(jié)果進(jìn)行NF(Neurofilament，神經(jīng)絲蛋白，為神經(jīng)元標(biāo)志抗原)、GFAP(GlialFibrillaryAcidicProtein，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白，為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志抗原)和GalC(Galactocerebroside,半乳糖腦苷脂，為少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志抗原)免疫組織化學(xué)鑒定。在神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化過程中進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果:體外培養(yǎng)達(dá)兩個(gè)月之久仍能保持增殖活性；單克隆培養(yǎng)可獲得

5、神經(jīng)干細(xì)胞球，對(duì)其進(jìn)行Nestin免疫細(xì)胞鑒定為陽性，證明為神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞體外分化可獲得各種神經(jīng)終末細(xì)胞，NF、GFAP和GalC鑒定結(jié)果均為陽性，證明可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 結(jié)論:應(yīng)用機(jī)械分離和無血清神經(jīng)元限定性培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法可獲得大量的神經(jīng)干細(xì)胞，這些神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化的潛能，可分化為神經(jīng)元等多種神經(jīng)終末細(xì)胞。 第二部分新生SD大鼠內(nèi)耳Corti氏器的分離與培養(yǎng) 目的:觀察

6、Corti氏器在神經(jīng)干細(xì)胞全培液中的生長情況，為下一步神經(jīng)干細(xì)胞和Corti氏器聯(lián)合培養(yǎng)作準(zhǔn)備。 方法:運(yùn)用顯微外科技術(shù)分離出新生一天SD大鼠的Corti氏器組織，利用貼壁培養(yǎng)的方法把Corti氏器組織放入DMEM／F12+B27培養(yǎng)基中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡和電鏡觀察Corti氏器在神經(jīng)干細(xì)胞全培液中的生長情況。 結(jié)果:SD大鼠耳蝸Corti氏器在DMEM／F12+B27培養(yǎng)基中生長達(dá)三周之久仍保持良好的生長態(tài)勢(shì)。培養(yǎng)一

7、周，掃描電鏡觀察，毛細(xì)胞及其纖毛結(jié)構(gòu)發(fā)育狀況與體內(nèi)基本相同；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，毛細(xì)胞及其纖毛等結(jié)構(gòu)有部分缺失，但仍顯示良好的生長趨勢(shì)。 結(jié)論:新生大鼠耳蝸Corti氏器組織可以在神經(jīng)干細(xì)胞全培液中生長，離體培養(yǎng)的Corti氏器中的毛細(xì)胞和纖毛等結(jié)構(gòu)發(fā)育與體內(nèi)情況近似。 第三部分神經(jīng)干細(xì)胞和Corti氏器聯(lián)合培養(yǎng) 目的:研究神經(jīng)干細(xì)胞和Corti氏器組織聯(lián)合培養(yǎng)的情況以及神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況。

8、方法:運(yùn)用神經(jīng)干細(xì)胞分化液neuralbasical以及TranswayFilter膜對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和新生一天SD大鼠內(nèi)耳Corti氏器組織進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，用毛細(xì)胞特異性標(biāo)記物MysinVIIA和神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物Dil進(jìn)行免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，倒置相差顯微鏡、電鏡以及激光共聚焦顯微鏡對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)的情況進(jìn)行觀察和鑒定。 結(jié)果:共培養(yǎng)3～5天時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞球離Corti氏器組織近側(cè)首先開始分化，顯示出神經(jīng)干細(xì)胞球向Corti氏器組織趨

9、化性生長和分化；聯(lián)合培養(yǎng)十天，神經(jīng)干細(xì)胞球分化出的神經(jīng)纖維長入了Corti氏器組織；至聯(lián)合培養(yǎng)兩周，在外毛細(xì)胞區(qū)可以看到三條閃光的條帶，在內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)可以看到一條閃光的條帶，高倍顯微鏡下可以看到神經(jīng)干細(xì)胞分化出的神經(jīng)纖維嵌入Corti氏器組織內(nèi)并形成清晰的紋路；掃描電鏡觀察，可以看到神經(jīng)干細(xì)胞分化出的神經(jīng)纖維穿過TranswayFilter膜上的小孔向Corti氏器趨化性生長；免疫組化和激光共聚焦顯微鏡觀察，可以看到綠色熒光antimys

10、inVIIA和紅色熒光神經(jīng)質(zhì)膜Dil的標(biāo)記，并可以看到黃色的混合色，說明神經(jīng)干細(xì)胞分化出的神經(jīng)纖維和毛細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了連接。 結(jié)論:神經(jīng)干細(xì)胞和新生SD大鼠Corti氏器組織不僅可以聯(lián)合培養(yǎng)，而且神經(jīng)干細(xì)胞在新生SD大鼠Corti氏器組織的誘導(dǎo)下發(fā)生分化并且向著Corti氏器組織趨化性生長，隨著聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)間的延長，神經(jīng)干細(xì)胞分化出的神經(jīng)纖維嵌入Corti氏器組織并在內(nèi)外毛細(xì)胞區(qū)域形成連接，至于神經(jīng)干細(xì)胞是否已經(jīng)分化為內(nèi)耳螺旋