青蒿素抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤淋巴管生成的作用和機(jī)制研究.pdf

1、淋巴管系統(tǒng)負(fù)責(zé)將組織液、外漏的蛋白和細(xì)胞回輸?shù)窖?。淋巴管系統(tǒng)也是機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)的重要組成部分。因此，在機(jī)體發(fā)育及病理情況下如炎癥和淋巴水腫，淋巴管系統(tǒng)起十分重要的作用。 腫瘤擴(kuò)散的重要機(jī)制之一是腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位，通過(guò)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，因此，淋巴系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中有重要的作用。淋巴結(jié)侵犯是決定腫瘤分期的重要因素，也是多種實(shí)體腫瘤包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌預(yù)后的重要因子。近年研究證實(shí)，腫瘤誘導(dǎo)的淋巴管生成促進(jìn)了癌細(xì)胞的

2、轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后差、生存率降低。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(VEGF-C)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D(VEGF-D)是最重要的兩個(gè)淋巴管生成因子，VEGF-C或VEGF-D可通過(guò)結(jié)合淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(VEGFR-3)，繼而促進(jìn)LEC增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，從而誘導(dǎo)淋巴管生成。因此，抑制LEC形成淋巴管以及抑制淋巴管生成因子的作用是尋找治療腫瘤轉(zhuǎn)移及其它淋巴管生成相關(guān)疾病的重要途徑。

3、 目的：研究青蒿素(ART)對(duì)Lewis肺癌(LLC)移植瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，并初步探討其作用機(jī)制。 方法： 1.建立C57BL/6小鼠LLC耳后近背側(cè)皮下移植瘤模型； 2.荷瘤小鼠被分為對(duì)照組和ART組(每組N=25)。ART組腫瘤移植后第2天開始灌胃給予ART(50mg/kg)，每?jī)商煲淮?，持續(xù)2周，測(cè)定腫瘤體積變化。第30天處死小鼠(每組n=10)，稱量瘤重、肺濕重，檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，并

4、檢查全身淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，包括同側(cè)頸上淋巴結(jié)群、對(duì)側(cè)頸上淋巴節(jié)群、臂部淋巴結(jié)群、椎旁淋巴結(jié)群、頸深淋巴結(jié)群、縱隔淋巴結(jié)群和腎上腺淋巴節(jié)群。免疫組化進(jìn)行LYVE-1和VEGFR-3染色，以LYVE-1陽(yáng)性淋巴管計(jì)算微淋巴管密度(LMVD)。RT-PCR和Westernblotting檢測(cè)VEGF-CmRNA和蛋白水平。另取兩組小鼠，使用ART處理后，計(jì)算60天內(nèi)中位生存期和生存率(每組n=15)； 3.不同濃度ART處理LLC細(xì)胞后

5、，Westernblotting和RT-PCR分別檢測(cè)VEGF-C蛋白和mRNA水平； 4.小鼠腹腔注射不完全弗氏佐劑(IFA)誘導(dǎo)淋巴管瘤形成；體外分離并培養(yǎng)LEC，免疫熒光和AnnexinV/PI雙染對(duì)LEC進(jìn)行鑒定； 5.LEC經(jīng)ART處理后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移，基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)管樣結(jié)構(gòu)形成。 結(jié)果： 1.LLC皮下移植后第30天，觀察對(duì)照組(每組n=10)同側(cè)

6、頸上、對(duì)則頸上轉(zhuǎn)移率為分別為100％和90％，而ART組分別為60％和40％，兩者具有顯著性差異(P＜0.05)。此外，ART組腋窩、椎旁和腎上腺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。而頸深和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率在對(duì)照組分別為70％和90％，ART組為50％和80％，兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。此外，ART組雙肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為50％，對(duì)照組為100％；兩組雙肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)分別為16.5±2.1和5.6±1.8(P＜0.05)；移

7、植瘤LMVD分別為29.9±3.4和11.0±2.7(P＜0.05)。然而，ART組和對(duì)照組移植瘤重分別為1.96±0.32和1.78±0.18，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 2.小鼠移植后第60天，生存率分析表明：兩組小鼠生存率(每組n=15)比較具有顯著差異(P＜0.05)。移植瘤小鼠給予ART后，中位生存期由38天提高至54天。 3.定量RT-PCR和Westernblotting表明，ART組和對(duì)照組移植

8、瘤VEGF-CmRNA和蛋白表達(dá)具有顯著差異(P＜0.05)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，不同濃度(5、10、20μmol/L)ART顯著降低LLC細(xì)胞表達(dá)VEGF-CmRNA和蛋白(P＜0.05)。 4.小鼠腹腔注射IFA成功誘導(dǎo)小鼠腹腔良性淋巴管瘤形成；從誘導(dǎo)的新生物中分離得到LYVE-1陽(yáng)性細(xì)胞；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示LYVE-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為60％-86％；免疫熒光結(jié)果表明LYVE-1表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。 5.凋亡結(jié)果顯示，

9、ART刺激的LEC發(fā)生固縮，染色質(zhì)邊集，具有典型的凋亡細(xì)胞特征；AnnexinV/PI雙染顯示：對(duì)照組LEC凋亡率為9.28％，10μmol/L和20μmol/LART處理的LEC凋亡率分別增加至42-36％和53.37％。MTT結(jié)果顯示，5、10、20和40μmol/LART對(duì)LEC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為7.78％、23.50％、40.72％和62.72％，具有顯著的劑量一效應(yīng)關(guān)系。此外，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的青蒿素對(duì)