miR-223調(diào)控Lewis肺腺癌轉(zhuǎn)移性干細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是威脅人類健康的最常見惡性腫瘤,盡管放化療和手術(shù)方法不斷進(jìn)展,但作為常見組織類型的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)總的5年生存率仍不足15％,其根本原因在于殘余腫瘤細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有治療手段的抗拒。新近癌干細(xì)胞理論的建立給抗腫瘤治療提供新的研究方向。癌干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中一個(gè)特殊的亞群,其突出特征是具有自我更新和不斷分化的能力,并與腫瘤細(xì)胞原發(fā)耐藥、新生血管形成乃至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等腫瘤演進(jìn)過程密切相關(guān)

2、。目前認(rèn)為,癌干細(xì)胞具有獨(dú)特的惡性表型,與非癌干細(xì)胞有著不同的表面分子標(biāo)志,在基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜上也有較為顯著的差別。
　　 微RNA(MicroRNA,miRNA)是一類小的非編碼RNA,長(zhǎng)度為18～25bp,它能通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,抑制mRNA的翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控編碼蛋白基因的表達(dá)。組織或細(xì)胞在某個(gè)特定階段存在自身特異的miRNA表達(dá)譜,可作為其特征性分子

3、標(biāo)志;關(guān)鍵miRNA參與干細(xì)胞自我更新、多向分化等特性的調(diào)控,并決定細(xì)胞的分化方向以及分化進(jìn)程。因此,研究miRNA對(duì)肺癌干細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用,就可能提供有效治療肺癌的方法。
　　 目的:
　　 1.從小鼠Lewis lung carcinoma(LLC)細(xì)胞系中尋找Sca-1、CXCR4雙陽(yáng)性細(xì)胞,并驗(yàn)證其是否具有癌轉(zhuǎn)移性干細(xì)胞特性。
　　 2.比較細(xì)胞分化相關(guān)miRNA在CXCR4陽(yáng)性與陰性LLC細(xì)胞中的

4、表達(dá)差異,并對(duì)差異表達(dá)顯著的miR-223進(jìn)行生物信息學(xué)初步研究。
　　 3.將miR-223真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至LLC細(xì)胞中,評(píng)價(jià)miR-223對(duì)LLC細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.流式分析Sca-1、CXCR4雙陽(yáng)性細(xì)胞比例,激光共聚焦檢測(cè)小鼠肺癌組織中雙陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況;以CXCR4作為磁珠分選細(xì)胞的表面標(biāo)志,檢測(cè)分選前后細(xì)胞活性,觀察分析CXCR4陽(yáng)性亞群的惡性生物學(xué)行為。<

5、br>　　 2.Trizol法抽提細(xì)胞總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan探針)檢測(cè)miRNAs表達(dá),對(duì)表達(dá)差異最為顯著的miRNA進(jìn)行潛在靶基因預(yù)測(cè),應(yīng)用RT-PCR、免疫組化方法初步分析具有研究?jī)r(jià)值的關(guān)鍵分子在兩個(gè)不同亞群細(xì)胞及移植瘤組織中的表達(dá)情況,并通過BLAST對(duì)其3'非翻譯端(3'-untranslated region,3'-UTR)進(jìn)行直向同源基因序列比對(duì)分析。
　　 3.構(gòu)建miR-223真核表達(dá)載體,

6、轉(zhuǎn)染后通過細(xì)胞劃痕、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)LLC細(xì)胞侵襲遷移能力的影響,流式細(xì)胞儀分析LLC細(xì)胞周期分布變化,ELISA檢測(cè)MMP9、VEGF表達(dá)水平,實(shí)時(shí)定量PCR、western blot檢測(cè)預(yù)測(cè)靶基因或通路蛋白表達(dá)情況。
　　 主要結(jié)果:
　　 1、LLC細(xì)胞中Sca-1、CXCR4雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為0.1％,CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞為0.18％,小鼠肺癌組織存在熒光雙染色細(xì)胞;分選前細(xì)胞活性為(95.58±0

7、.87)％,分選后活力為(94.96±0.76)％(P＞0.05);CXCR4陽(yáng)性亞群在無血清中呈球狀生長(zhǎng),CCK-8法顯示增殖能力明顯高于陰性亞群(P＜0.05);CXCR陰性亞群1×105即不可成瘤,CXCR4陽(yáng)性亞群在7×103仍可成瘤。
　　 2、CXCR4陽(yáng)性LLC多毗鄰內(nèi)皮細(xì)胞,周圍形成血管樣結(jié)構(gòu);CXCR4陽(yáng)性LLC的VEGF mRNA表達(dá)(0.440±0.006)明顯高于CXCR4陰性LLC(0.290±0.00

8、3)(P＜0.01);CXCR4陽(yáng)性LLC移植瘤組織MVD(56.87±4.83),明顯高于CXCR4陰性LLC移植瘤(43.52±4.91)(P＜0.01)。
　　 3、CXCR4陽(yáng)性亞群組微膜下細(xì)胞數(shù)為109.67±20.03個(gè),顯著高于CXCR4陰性亞群組的53.67±13.01個(gè),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),CXCR4陽(yáng)性亞群MMP9mRNA表達(dá)(0.622±0.014)明顯高于CXCR4陰性亞群(0.579±0

9、.017)(P＜0.05);CXCR4陰性和陽(yáng)性亞群分別以5×105、2×104密度各接種3只小鼠,前者無轉(zhuǎn)移,而后者2只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,1只發(fā)生耳轉(zhuǎn)移。
　　 4、CXCR4陽(yáng)性與陰性LLC比較,具有對(duì)順鉑更強(qiáng)的抗拒性(P＜0.05);CXCR4陽(yáng)性LLC的ABCG2 mRNA表達(dá)(0.524±0.008)明顯高于CXCR4陰性LLC(0.387±0.007)(P＜0.01)。
　　 5、CXCR4陽(yáng)性與陰性LLC比較比較

10、,各檢測(cè)miRNA表達(dá)均較低,其中以miR-223差異最為顯著(Fold Change=8.26),通過軟件分析預(yù)測(cè),miR-223與IGF1R、IGFBP5、Pik3cb、ELK-1和E2F1等基因均具有可能靶位點(diǎn),CXCR4陽(yáng)性LLC的IGF1R mRNA表達(dá)(0.421±0.007)明顯高于CXCR4陰性LLC(0.185±0.007)(P＜0.01),免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CXCR4+亞群種植瘤組織IGF1R表達(dá)顯著高于CXCR4陰性

11、亞群,IGF1R mRNA3'-UTR的238～244和688～695nt兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有高度的進(jìn)化保守性。
　　 6、miR-223重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示LLC細(xì)胞遷移(218.67±39.80μm),與正常對(duì)照組(341.67±35.92μm)比較,遷移能力顯著受抑(P＜0.05);Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示微膜下細(xì)胞數(shù)為(60.67±12.66個(gè)),與正常對(duì)照組(100.33±14.01個(gè))比較,侵襲

12、能力明顯下降(P＜0.05);ELISA檢測(cè)MMP9濃度為(214.16±28.18pg/mL),與正常對(duì)照組(1139.14±50.13pg/mL)比較,差異非常顯著(P＜0.01);流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G0/G1細(xì)胞減少(53.8％→45.3％),G2細(xì)胞增加(4.29％→13.2％)。
　　 7、miR-223重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示IGF1R、CXCR4、CDK2等預(yù)測(cè)靶基因及MMP9 mRNA表達(dá)

13、分別下調(diào)大約17、12、25和15倍,與正常對(duì)照組比較,差異非常顯著(P＜0.01);western blot結(jié)果顯示預(yù)測(cè)靶基因蛋白表達(dá)也明顯減少,IGF1R下游Akt、Erk信號(hào)通路明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1、Lewis肺癌細(xì)胞中的CXCR4陽(yáng)性亞群具有一定的自我更新和轉(zhuǎn)移能力,具備癌轉(zhuǎn)移干細(xì)胞某些特性,Sca-1、CXCR4可以作為小鼠肺腺癌轉(zhuǎn)移性干細(xì)胞的表面標(biāo)志。
　　 2、miR-223在CXCR