Pim-1信號(hào)在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 炎癥性腸病(IBD)是一組反復(fù)發(fā)作非特異性的腸道炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但免疫因素在IBD中重要作用已被廣大學(xué)者所公認(rèn)。Pim-1基因最初是在鼠白血病病毒(MuLV)誘導(dǎo)的T-細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的，目前研究表明Pim-1激酶在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生等許多生理病理過程中起重要作用，近年來Pim-1在免疫系統(tǒng)的作用逐漸受到重視，參與控制T淋巴細(xì)胞的增殖與凋亡，但是目前關(guān)于Pim-1信號(hào)是否能調(diào)節(jié)

2、IBD腸粘膜固有及適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本課題利用DSS誘導(dǎo)急性小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，以觀察Pim-1表達(dá)與腸道炎癥程度關(guān)系為切入點(diǎn)，進(jìn)一步使用Pim-1抑制劑，觀察對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，并探討對(duì)Th1/Th2、Treg/Th17細(xì)胞分化的影響，同時(shí)探討Pim-1信號(hào)在巨噬細(xì)胞激活方面的作用，本課題從動(dòng)物、細(xì)胞、分子水平多方面來探討Pim-1信號(hào)通路對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎腸粘膜固有及適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，

3、以闡明Pim-1信號(hào)與腸道異常免疫反應(yīng)的關(guān)系，為潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的靶點(diǎn)、為深入Pim-1信號(hào)的藥理研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一章 Pim-1在小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型中的表達(dá)
　　 目的:觀察Pim-1在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并觀察其與炎癥程度的相關(guān)性。方法:BALB/c小鼠飲用5％ DSS溶液建立急性潰瘍性結(jié)腸炎模型，分別在第0、1、4、7天取結(jié)腸標(biāo)本，利用real time PCR、Wester

4、n Blot及免疫組化動(dòng)態(tài)觀察Pim-1表達(dá)，分析Pim-1的表達(dá)和DAI、組織學(xué)炎癥評(píng)分的相關(guān)性。結(jié)果:①飲用5％DSS7天后成功建立小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，②real timePCR、Western Blot結(jié)果顯示在飲用5％DSS第4、7天后Pim-1表達(dá)較正常組及第1天均明顯升高，P＜0.05，免疫組化顯示Pim-1主要在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞表達(dá)。③Pearman相關(guān)分析表明，結(jié)腸組織中Pim-1蛋白與DAI呈正

5、相關(guān)(R=0.868，P＜0.01)，與組織病理學(xué)評(píng)分亦呈正相關(guān)(R=0.851，P＜0.01)。結(jié)論:在潰瘍性結(jié)腸炎起病過程中Pim-1的表達(dá)與腸道炎癥程度呈正相關(guān)，Pim-1信號(hào)參與腸道炎癥反應(yīng)。
　　 第二章 Pim-1信號(hào)對(duì)Th細(xì)胞分化、及巨噬細(xì)胞激活的影響
　　 目的:用PIM-Inh阻斷Pim-1信號(hào)，觀察對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，同時(shí)研究PIM-Inh對(duì)腸粘膜中Th細(xì)胞分化及巨噬細(xì)胞激活的影

6、響。方法:①應(yīng)用PIM-Inh阻斷Pim-1信號(hào)，治療7天后，觀察對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，②ELISA檢測Th細(xì)胞因子(IL4，TGF-β，IFN-γ，IL17)，③real time PCR、Western Blot檢測Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(GATA3，T-bet，F(xiàn)oxp3，RORrt)，④Western Blot檢測腸道組織巨噬細(xì)胞激活標(biāo)記物NF-κB，iNOS的表達(dá)。結(jié)果:①PIM-Inh治療組小鼠血便、腹瀉癥

7、狀、DAI評(píng)分、病理組織學(xué)評(píng)分較DSS模型組均好轉(zhuǎn)，②與DSS模型組比較，PIM-Inh治療組腸組織中IFNγ、IL17表達(dá)下降，P＜0.05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高劑量治療組下降更加明顯;PIM-Inh治療組腸組織中TGFβ的表達(dá)較模型組升高，其高劑量組升高較明顯，P＜0.05，而低劑量治療組與模型組比較，P＞0.05，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PIM-Inh治療組腸組織中IL4的表達(dá)較DSS模型組稍下降，但P＞0.05，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、，③real time PCR、Westem Blot結(jié)果顯示:PIM-Inh治療組腸組織中T-bet，ROR-γt較DSS模型組明顯下降，而FOXP3的表達(dá)比模型組明顯升高，P＜0.05，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是對(duì)GATA-3的表達(dá)無明顯影響，④PIM-Inh治療組腸組織中p-NF-κB P65，iNOS的表達(dá)較DSS模型組明顯下降，P＜0.05。結(jié)論:阻斷Pim-1信號(hào)可抑制巨噬細(xì)胞活化、抑制Th1、Th17為主的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)向Tr

9、eg細(xì)胞分化，從而對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有治療作用。
　　 第三章 Pim-1對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　 目的:觀察LPS對(duì)Pim-1表達(dá)的影響，阻斷Pim-1對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響方法:①不同劑量LPS作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞，分別在12h、24h后用real timePCR及Western Blot檢測Pim-1的表達(dá)，②在LPS刺激前給予Pim-1特異性抑制劑(PIM-

10、Inh)，Western Blot檢測pNF-kB P65的表達(dá)，ELISA測定TNF-α的表達(dá)。結(jié)果:①與正常對(duì)照比較，100ng/ml，1ug/ml的LPS均可以促進(jìn)Pim-1的表達(dá)，其中1ug/ml更加明顯，P＜0.05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同一濃度LPS作用12h后比24h后Pim-1升高更加明顯，P＜0.05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義②用10 umol/L，100 umol/L PIM-Inh預(yù)處理后，NF-κBp65、TNFα蛋白