MicroRNA-126在潰瘍性結(jié)腸炎中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、[目的]微小RNA(MicroRNA，miRNA)與炎癥的關(guān)系研究倍受重視，本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)組織中miR-126的表達(dá)顯著上調(diào)，且與IκBα mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-126與IκBα mRNA的調(diào)節(jié)可能有關(guān)。miR-126是否通過抑制IκBα mRNA的表達(dá)，進(jìn)而影響核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活化，參與UC的炎癥過程尚需進(jìn)

2、一步明確。本研究旨在通過熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)了解大腸細(xì)胞中miR-126對(duì)靶基因IκBα的作用，為探討miR-126和IκBα在參與UC發(fā)生、發(fā)展過程中的可能機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 [方法]利用Microcosm軟件預(yù)測(cè)miR-126調(diào)控基因IκBα的結(jié)合區(qū)域；設(shè)計(jì)IκBα基因3'-UTR序列及突變后的IκBα基因3'-UTR序列的上下游引物，采用串聯(lián)PCR反應(yīng)，以各自的上下游引物為模板，擴(kuò)增得到含IκBα基因3'-UTR序列

3、和突變后的IκBα基因3'-UTR序列的目的片段，并將它們分別克隆到含有熒光素酶報(bào)告基因的載體PisCHECKTM-2上，獲得2種含miR-126不同結(jié)合位點(diǎn)的重組載體；采用脂質(zhì)體技術(shù)分別將這些重組載體及空載體PisCHECKTM-2與miR-126和/或miR-126 inhibitor、MiR-RiboTM mimics Negative Control和/或MiR-RiboTM inhibitor Negative Control

4、共轉(zhuǎn)染至HT-29，應(yīng)用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。
　　 [結(jié)果]PCR電泳結(jié)果顯示，采用串聯(lián)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到正確的含IκBα基因3'-UTR序列和突變后的IκBα基因3'-UTR序列的目的片段；PCR鑒定和測(cè)序鑒定結(jié)果顯示，成功構(gòu)建分別含有miR-126結(jié)合位點(diǎn)和其突變位點(diǎn)的兩種重組質(zhì)粒PisCHECKTM-2κBα和PisCHECKTM-2 mutIκBα。
　　 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析測(cè)定結(jié)果顯示，

5、在轉(zhuǎn)染空載實(shí)驗(yàn)中，miR-126組分別與空白組和陰性對(duì)照組比較，熒光素酶的活性值差異無顯著性(P>0.05)；在轉(zhuǎn)染克隆有mutIκBα基因3'-UTR質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-126組分別與空白組及陰性對(duì)照組比較，熒光素酶的活性值差異無顯著性(P>0.05)；在轉(zhuǎn)染克隆有IκBα基因3'-UTR質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-126組熒光素酶活性明顯受到抑制，分別與空白組及陰性對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.05)，但在miR-126與miR-126