大黃多糖治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因不明的反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性結(jié)腸炎癥,為消化系統(tǒng)疾病中常見(jiàn)的難治性疾病。近年來(lái),UC在我國(guó)的發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì),越來(lái)越引起人們重視。目前,UC的治療措施主要為抗炎抗免疫,例如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、非甾體抗炎藥的應(yīng)用等,但臨床治療效果并不滿意,且長(zhǎng)期應(yīng)用副作用嚴(yán)重。因此,急需尋找療效良好、副作用較小的治療方法。唐古特大黃為傳統(tǒng)的胃腸道用藥,臨床上

2、長(zhǎng)期用于胃腸道疾病的治療,療效顯著。本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化獲得了唐古特大黃多糖(Rheum tanguticum polysaccharide, RTP),發(fā)現(xiàn)RTP對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎療效顯著。為了深入研究RTP的作用機(jī)制,本課題從前期實(shí)驗(yàn)分離純化得到的RTP中再分離得到了分子量較低的組分RTP-2,經(jīng)過(guò)糖含量和儀器分析發(fā)現(xiàn)該組分為含有蒽醌的多糖復(fù)合物。為了進(jìn)一步探討 RTP-2的生物活性,本課題采用酶解的方法,對(duì) RTP-2作進(jìn)一步的酶

3、降解分離純化得到新的不含蒽醌的大黃多糖片段RTP-2A。然后,采用TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC模型,將二者對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎治療作用及其對(duì)腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行對(duì)照研究;并在細(xì)胞水平深入研究RTP-2、RTP-2A和大黃素(Emodin)對(duì)LPS致炎的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響,以及RTP-2、RTP-2A與巨噬細(xì)胞甘露糖受體的結(jié)合特性。本課題旨在通過(guò)上述研究探討含有蒽醌的RTP-2與其酶解后不含有蒽醌的多糖片段RTP-2A,在UC治療、腸

4、道菌群失調(diào)和免疫功能方面調(diào)節(jié)作用的差異,以期進(jìn)一步探討大黃多糖對(duì)結(jié)腸炎的治療機(jī)制,為UC的治療以及多糖藥物研究提供新的線索。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分:RTP-2的酶解、分離和純化:采用β-甘露聚糖酶酶解RTP-2,RTP-2為100~200 KD且含有蒽醌的多糖復(fù)合物,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳酶解工藝,以Sephadex G-100凝膠柱分離、純化酶解得到的多糖片段,并通過(guò)HPLC檢測(cè)純化后多糖片段中蒽醌的含量。

5、r>　　第二部分:觀察RTP-2及RTP-2A對(duì)TNBS誘導(dǎo)大鼠試驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用:采用40％乙醇和TNBS混懸后給大鼠灌腸復(fù)制模型,動(dòng)物分組為:正常對(duì)照組(normal)和模型組(TNBS)給0.2 ml/day生理鹽水,RTP-2治療組(RTP-2)200mg/kg/day,RTP-2A治療組(RTP-2A)200mg/kg/day和DEX陽(yáng)性對(duì)照組(DEX)0.2mg/kg/day;每組10只,造模后6h灌胃給藥,連續(xù)給藥5天

6、,每天1次,治療結(jié)束后,大鼠禁食不禁水24h,乙醚麻醉處死動(dòng)物,解剖收集肛門(mén)以上約8cm結(jié)腸,用于疾病活動(dòng)指數(shù)、潰瘍指數(shù)及病理學(xué)檢測(cè)及評(píng)分;比較RTP-2、RTP-2A與DEX對(duì)UC的療效。
　　第三部分:臨床 UC患者糞便菌群及 UC大鼠腸道菌群分析:采集臨床確診為UC且近四周未服用抗菌藥物的患者的新鮮糞便(65例),參考《腸道菌群糞便涂片檢查圖譜》進(jìn)行腸道菌群失調(diào)的分度診斷。結(jié)腸炎大鼠分組同第二部分為:正常對(duì)照組(normal

7、)、模型組(TNBS) RTP-2治療組,RTP-2A治療組和Emodin陽(yáng)性藥對(duì)照組(Emodin)20 mg/kg/day。TNBS復(fù)制模型,給藥5天后,乙醚麻醉處死,在無(wú)菌操作臺(tái)取盲腸段大鼠糞便,涂片檢查腸道菌群失調(diào)的分度;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)定量分析上述各 UC大鼠盲腸糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、脆弱擬桿菌及腸球菌的變化情況,比較RTP-2、RTP-2A與Emodin對(duì)UC大鼠菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)作用。
　　第四部分:觀察RTP

8、-2及RTP-2A對(duì)LPS誘導(dǎo)炎癥因子分泌的拮抗作用:以巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為研究對(duì)象,Man-FITC-BSA為配體,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn),以熒光顯微鏡和多功能酶標(biāo)儀定性、定量的觀察巨噬細(xì)胞熒光染色情況,比較RTP-2、RTP-2A及MR單抗與RAW264.7中MR的結(jié)合能力的差異;然后,通過(guò)ELISA和Western blot的方法觀察RTP-2及RTP-2A對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7分泌的細(xì)胞因子TNF-α及NO的影響,并

9、對(duì)其可能的信號(hào)通路進(jìn)行研究。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.通過(guò)β-甘露聚糖酶對(duì) RTP-2的酶解、分離和純化,獲得分子量分別為7000-11000、20000-35000、2000-3000的多糖片段RTP-2A,RTP-2B和RTP-2C,其中RTP-2A量最多,且未檢測(cè)到蒽醌,其甘露糖含量為41.36%。
　　2.RTP-2、RTP-2A對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠試驗(yàn)性結(jié)腸炎療效顯著,RTP-2、RTP-2A和DEX對(duì)UC大

10、鼠疾病活動(dòng)指數(shù)沒(méi)有差異(P>0.05),對(duì)于大體形態(tài)評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分的作用:RTP-2>RTP-2A>DEX(P<0.05),病理結(jié)果顯示:RTP-2及RTP-2A可顯著促進(jìn)黏膜上皮的修復(fù)和再生,其病理評(píng)分為:RTP-2>RTP-2A>DEX(P<0.05),含有蒽醌的RTP-2的抗炎作用優(yōu)于不含蒽醌的RTP-2A。
　　3.65例UC患者中45例(69.3%)發(fā)生菌群失調(diào),而TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠均發(fā)生菌群失調(diào),較 UC患者的菌

11、群失調(diào)分度更為嚴(yán)重。實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果提示,UC大鼠腸道益生菌雙歧桿菌和乳酸桿菌明顯減少,而條件致病菌脆弱擬桿菌和腸球菌過(guò)度增殖。RTP-2及RTP-2A均可逆轉(zhuǎn)該菌群失調(diào),使腸道菌群恢復(fù)平衡,且含有蒽醌的RTP-2效果更優(yōu),其對(duì)脆弱擬桿菌及腸球菌抑制作用優(yōu)于RTP-2A組(P<0.05)。Emodin治療組大鼠腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌未見(jiàn)明顯變化,而對(duì)脆弱擬桿菌、腸球菌有抑制作用,與TNBS組大鼠相比有顯著性差異(P<0.05),但E

12、modin對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌促增殖的作用不及RTP-2與RTP-2A(P<0.05)。
　　4. RTP-2及RTP-2A與MR具有一定的親和力,親和力強(qiáng)弱為:MRmAb>RTP-2A>RTP-2。RTP-2、RTP-2A及Emodin均可拮抗LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α及NO的分泌,拮抗LPS誘導(dǎo)的磷酸化p65蛋白表達(dá)的上調(diào);該作用可被MR單抗阻斷;但RTP-2的作用弱于RTP-2A(P<0.05)。
　　結(jié)論：

13、　　1.在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上,將RTP進(jìn)一步分離純化得到分子量較低的組分RTP-2,經(jīng)糖含量與儀器分析發(fā)現(xiàn)該組分為含有蒽醌的多糖復(fù)合物;為了探討蒽醌對(duì)低分子量大黃多糖作用的影響,再將RTP-2進(jìn)行酶解、分離和純化,獲得不含有蒽醌的RTP-2A;二者均為新的大黃多糖片段,未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　2. RTP-2、RTP-2A及DEX對(duì)大鼠UC具有良好的治療作用,RTP-2與RTP-2A主要通過(guò)對(duì)結(jié)腸粘膜異常免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和促進(jìn)粘膜

14、的修復(fù)、再生來(lái)治療UC,而DEX對(duì)UC的治療作用主要體現(xiàn)在炎癥抑制上。RTP-2、RTP-2A抑制炎癥反應(yīng)的作用,可能與其抑制NF-κB的活化,降低TNF-α的分泌有關(guān)。
　　3. TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠較臨床UC患者腸道菌群紊亂更加嚴(yán)重。RTP-2及RTP-2A均可逆轉(zhuǎn)TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠的菌群失調(diào),促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌增殖,抑制脆弱擬桿菌及腸球菌增殖;而Emodin治療組僅對(duì)脆弱擬桿菌和腸球菌有一定的抑制作用,對(duì)乳酸桿菌和