泛素化對(duì)多器官功能障礙綜合征脾臟樹突狀細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究多器官功能障礙綜合征(multiple organs dysfunction syndrome,MODS)病程中脾臟樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)的變化及MHC-Ⅱ蛋白的泛素依賴性作用,證實(shí)泛素-蛋白酶體途徑在MODS病程中對(duì)脾臟DCMHC-Ⅱ變化及DC功能的影響,探討E3泛素連接酶MARCH1在MODS第一次打擊期對(duì)脾臟DCMHC-Ⅱ泛素化調(diào)節(jié)的作用機(jī)制,并觀察干預(yù)MARCH1對(duì)MODS第一次打擊期脾臟D

2、C免疫功能的影響,進(jìn)而為MODS的免疫調(diào)節(jié)與防治尋找新的靶點(diǎn)。
　　方法:采用腹腔注射酵母多糖復(fù)制MODS小鼠模型。120只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和MODS1d、3d、5d、7d和10d組。各組實(shí)驗(yàn)小鼠分別分離脾臟和胸腺組織,一部分脾臟應(yīng)用免疫熒光方法檢測CD11c+DC數(shù)量的變化,剩余組織應(yīng)用MiniMACS免疫磁珠分別分離DC和T細(xì)胞用于體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、Real-TimePCR、Western Blot和MTT

3、法等檢測DC對(duì)CD86、MHC-Ⅱ、泛素、E3泛素連接酶(MARCH1-8)的表達(dá),DC分泌IL-12、TNF-α的水平以及誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ的水平。接著運(yùn)用免疫共沉淀及Western Blot檢測正常對(duì)照組和MODS1d組DCMHC-Ⅱ蛋白泛素化水平,并用MG132分別處理兩組DC各6h,運(yùn)用PI染色法、Real-TimePCR、Western Blot和MTT法等檢測處理前后各組DC的凋亡率,DC對(duì)MHC-Ⅱ蛋

4、白的表達(dá)以及誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。通過從小鼠尾部提取cDNA作為模板,采用特異的引物,運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)擴(kuò)增出MARCH1cDNA片段,EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后,連接于載體pMB-HA質(zhì)粒上,構(gòu)建pMB-HA-MARCH1重組載體,經(jīng)雙酶切和DNA測序分析檢測重組載體構(gòu)建結(jié)果,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)菌、篩選陽性克隆、抽提質(zhì)

5、粒并進(jìn)行純化。將pMB-HA-MARCH1表達(dá)載體和SiRNA分別轉(zhuǎn)染進(jìn)MODS1d組DC,運(yùn)用MTT法、PI染色法、流式細(xì)胞術(shù)、Real-TimePCR、免疫共沉淀及Western Blot等比較MODS1d組、MARCH1siRNA敲低組和MARCH1過表達(dá)組DC的形態(tài)、活力和凋亡率,DC對(duì)MHC-Ⅱ蛋白的表達(dá)和泛素化水平以及誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。
　　結(jié)果:MODS病程中CD11c+DC

6、數(shù)量逐漸減少,DC表面MHC-Ⅱ和CD86蛋白,DC分泌的IL-12、TNF-α和其介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖活性以及T細(xì)胞分泌的IL-2和IFN-γ的表達(dá)均為先升高,在MODS1d組達(dá)到峰值,此后下降,至MODS期降到最低點(diǎn),但MHC-Ⅱ和泛素的mRNA水平變化均不明顯。而E3泛素連接酶中MARCH1的變化最顯著,mRNA和蛋白水平表達(dá)均為先下降,在MODS1d組達(dá)到最低值,后略有升高趨勢,直至MODS10d組又有所下降。在MODS病程中MHC

7、-Ⅱ與MARCH1的變化趨勢大致相反。MODS1d組脾臟DCMHC-Ⅱ蛋白泛素化程度較正常對(duì)照組顯著降低,MG132處理前后兩組DC凋亡率無明顯變化,而DCMHC-Ⅱ蛋白的表達(dá)以及誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平均為MODS1d組與MG132處理后的正常對(duì)照組比正常對(duì)照組高,其中前者比后者稍高,MG132處理后的MODS1d組為最高。成功構(gòu)建了E3泛素連接酶MARCH1的真核表達(dá)載體pMB-HA-MARCH1,

8、并合成了3條效果比較理想的MARCH1的siRNA。對(duì)MODS1d組DC進(jìn)行MARCH1過表達(dá)和siRNA敲低干預(yù),發(fā)現(xiàn)三組DC的形態(tài)、活力和凋亡率均無明顯變化,而MARCH1過表達(dá)干預(yù)可以增加MHC-Ⅱ的泛素化程度,減少M(fèi)HC-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平,并降低DC誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的功能;而MARCH1siRNA敲低干預(yù)則相反可以降低MHC-Ⅱ的泛素化程度,增加MHC-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平,并增強(qiáng)DC誘導(dǎo)T細(xì)胞增

9、殖和分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α的功能。
　　結(jié)論:1、在MODS第一次打擊期DC的數(shù)量雖有下降,但其抗原提呈功能與激活T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力卻是增強(qiáng)的;而到了MODS期,DC的數(shù)量及功能均降至最低,機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。2、在MODS病程中,是MARCH1通過泛素化降解MHC-Ⅱ減少了小鼠脾臟DCMHC-Ⅱ的表達(dá)。3、在MODS中脾臟DCMHC-Ⅱ的變化確實(shí)是具有泛素依賴性。4、成功構(gòu)建了E3泛素連接酶MARCH1