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文檔簡介
1、目的: 1.研究MODS小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞(DC)病變對多種炎癥因子變化的影響及其分子機(jī)制。 2.探討膽堿能抗炎通路對MODS早期DC及細(xì)胞免疫功能的影響與調(diào)節(jié)作用。 3.研究Flt3L對MODS免疫失衡的可能保護(hù)效應(yīng)。 方法:腹腔注射酵母多糖復(fù)制小鼠MODS模型,實(shí)驗(yàn)分組: (1)正常對照組(n=30); (2)MODS組(n=150)又分為6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、6日和10~12日
2、組; (3)卡巴膽堿治療組(n=30):致傷前小鼠經(jīng)胃給予卡巴膽堿(3μg/kg,三次); (4)Flt3L治療組(n=30):在MODS病程緩解期腹腔注射Flt3L(5μg/kg/日,連續(xù)7天)。分別在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)采取血和肺、肝、腎、脾臟等組織標(biāo)本。采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)分離純化脾臟DC,運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測脾臟DC免疫表型、外周血T細(xì)胞亞群和外周血單個(gè)核細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測DC孵育
3、上清及組織勻漿液的細(xì)胞因子,用熒光定量PCR檢測DC中NF-κBp65mRNA表達(dá)水平。免疫組化檢測脾臟中CD86、IL-1β、IL-10和HMGB1表達(dá)。光、電鏡觀察各組臟器結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果: (1)IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)量在傷后6、24小時(shí)組明顯升高,48小時(shí)至10~12日組降至正常水平。HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)量在傷后6小時(shí)組開始升高,于48小時(shí)組達(dá)峰值;6日組降至正常,10~12日組再次明顯升高;IL-10陽性細(xì)胞數(shù)量
4、在傷后48小時(shí)組開始升高,10~12日組達(dá)峰值; (2)脾臟DC的含量在6和24小時(shí)組明顯增加,48小時(shí)組開始下降,6日組接近正常組,10~12日DC數(shù)量再次明顯增生;傷后6和124小時(shí)組DC表面分子MHC-Ⅱ和CD86的表達(dá)明顯增高,48小時(shí)和6日組MHC-Ⅱ和CD86下降至正常水平,10~12日組MHC-Ⅱ和CD86的表達(dá)明顯降低。DC孵育上清中IL-12p70含量在傷后6、24小時(shí)組明顯增加,48小時(shí)和6日組恢復(fù)至正常水平
5、,10~12日組IL-12p70含量明顯降低。傷后6、24小時(shí)組DC細(xì)胞中NF-κB p65mRNA的表達(dá)顯著增加,10~12日組NF-κBp65mRNA表達(dá)明顯下降。 (3)傷后6~48小時(shí)組,實(shí)驗(yàn)鼠臟器功能指標(biāo)中ALT升高,其余改變不明顯。外周血中單核細(xì)胞對MHC-Ⅱ分子表達(dá)及CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)均減少,CD4/CD8比值下降。病理改變主要為部分臟器實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性伴間質(zhì)淤血、水腫;6日組,實(shí)驗(yàn)鼠功能與形態(tài)均有好轉(zhuǎn)。外周血單核
6、細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達(dá)及CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)均有增加,CD4/CD8比值回升。10~12日組,各項(xiàng)生化指標(biāo)均顯著上升,外周血單個(gè)核細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達(dá)降至最低點(diǎn),CD4<'+>T細(xì)胞也明顯減少,CD4/CD8比值明顯下降。主要臟器實(shí)質(zhì)細(xì)胞多呈變性與灶狀壞死改變。 (4)卡巴膽堿治療組脾臟DC對MHC-Ⅱ表達(dá)下降,脾臟中IL-12 p70水平下降;脾臟中IL-1β和HMGB1陽性細(xì)胞明顯下降;臟器功能與形態(tài)改變均較輕微。
7、 (5)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)1μmol/ml、10μmol/ml和100μmol.ml濃度的卡巴膽堿均能夠降低LPS刺激的培養(yǎng)DC對MHC-Ⅱ的表達(dá)及其IL-12 p70的分泌。其中卡巴膽堿濃度在100μmol/ml時(shí)對DC表面MHC-Ⅱ表達(dá)和DC分泌IL-12p70的抑制作用最明顯。α-銀環(huán)蛇毒素可明顯阻斷卡巴膽堿的上述效應(yīng)。 (6)Flt3L治療組脾臟DC對MHC-Ⅱ表達(dá)明顯增加,脾組織中IL-12p70水平明顯升高,外周血單個(gè)核
8、細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達(dá)增加,CD4<'+>T細(xì)胞數(shù)也明顯增多,CD4/CD8比值明顯上調(diào)。脾臟中IL-10陽性細(xì)胞數(shù)下降;肝、腎功能指標(biāo)接近正常組,肺、肝、腎、心和脾臟病理改變較MODS12日組明顯減輕。 結(jié)論: 1.脾臟樹突狀細(xì)胞的活性變化與多種炎癥因子表達(dá)的變化在MODS病程中具有密切的相關(guān)性和規(guī)律性。 2.樹突狀細(xì)胞對MODS炎癥反應(yīng)的方向具有影響和調(diào)節(jié)作用。NF-κB-IL-12途徑是樹突狀細(xì)胞免疫.炎癥
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