微小RNA在HMGB1介導(dǎo)小鼠脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能中的調(diào)控作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的:膿毒癥時(shí)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為晚期炎癥介質(zhì)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的重要成員能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)免疫功能紊亂，但其分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。微小RNA(miRNAs，miR)對(duì)mRNA發(fā)揮著轉(zhuǎn)錄后精細(xì)調(diào)控作用。本研究擬從miRNAs的角度探討HMGB1誘導(dǎo)DCs成熟活化的分子調(diào)控機(jī)制，旨在為進(jìn)一步探索嚴(yán)重?zé)▌?chuàng)）傷后膿毒癥的免疫調(diào)控途徑提供新線(xiàn)索。
　　方法:第一部分，外源性HMGB1對(duì)小鼠脾臟DCs

2、細(xì)胞免疫功能的影響。參考本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)大鼠脾臟DCs研究的基礎(chǔ)，用0、100、1000ng/ml三個(gè)濃度的重組HMGB1刺激正常小鼠脾臟DCs，48h后分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面標(biāo)志物及共刺激分子(CD80、CD86、MHCⅡ)的表達(dá)情況;應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)DCs分泌細(xì)胞因子IL-12、TNF-α的水平;將HMGB1刺激48h后的DCs與脾臟T淋巴細(xì)胞按1∶100的比例共培養(yǎng)，于3天(d)后采用CCK-8試劑盒觀察T淋巴細(xì)胞對(duì)

3、絲裂原刺激的增殖反應(yīng)，用ELISA技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中干擾素(IFN-γ)（判斷Th1/Th2功能分化）和IL-2（反映T細(xì)胞的分泌功能）的表達(dá)水平，最終確定HMGB1誘導(dǎo)DCs成熟活化的適合劑量。第二部分，HMGB1誘導(dǎo)小鼠脾臟DCs成熟活化后miRNA表達(dá)譜的研究。采用miRNAs芯片檢測(cè)經(jīng)HMGB1刺激活化后DCs中miRNAs表達(dá)譜的變化。結(jié)合芯片結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，鎖定可能發(fā)揮作用的差異表達(dá)miR:miR-181a-5p，通過(guò)RT-P

4、CR方法驗(yàn)證該miR的表達(dá)量變化情況。第三部分，miR-181a-5p靶基因預(yù)測(cè)以及體外功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)miR-181a-5p的靶mRNA，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)這一假設(shè)，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p的mimics或inhibitor上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞內(nèi)該miR表達(dá)量，用RT-PCR方法檢測(cè)其靶mRNA的表達(dá)量，從功能上驗(yàn)證miR-181a-5p對(duì)靶mRNA的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:第一部分，與正常對(duì)照組(HMGB1濃度0

5、ng/ml組)相比，HMGB1(100ng/ml和1000ng/ml)作用48h后DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)以及DCs分泌IL-12、TNF-α的水平均呈現(xiàn)雙向調(diào)控現(xiàn)象，即在HMGB1濃度為100ng/ml時(shí)上調(diào)顯著(P＜0.05或P＜0.001)，而HMGB1濃度為1000ng/ml時(shí)各指標(biāo)反而有所下降，尤其是IL-12，分泌水平反而低于HMGB1(0ng/ml)組(P＜0.01);DCs與脾臟T淋巴細(xì)胞共培

6、養(yǎng)后，經(jīng)HMGB1刺激的DCs能顯著增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刺激的增殖反應(yīng)(P＜0.01)，促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化[IFN-γ表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)]以及T細(xì)胞分泌功能增加[IL-2表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)]，且符合上述雙向調(diào)控現(xiàn)象，各指標(biāo)在HMGB1（100ng/ml）組表達(dá)水平最高。通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn)我們確定了100ng/ml為誘導(dǎo)DCs成熟活化的適合劑量。第二部分，100ng/mlHMGB1刺激DCs后用miRNA

7、s芯片篩選出14個(gè)差異表達(dá)miRNAs，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)上調(diào)的miR-181a-5p(P＜0.05)可能與HMGB1誘導(dǎo)的DCs免疫功能紊亂密切相關(guān)。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了其上調(diào)趨勢(shì)(P＜0.01)和芯片結(jié)果一致，且也存在HMGB1的雙向調(diào)控現(xiàn)象。第三部分，通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)TNF-α3'untranslated region(UTR)可能存在miR-181a-5p的靶基因位點(diǎn)，于是構(gòu)建包含預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)的TNF-α野生型(WT)和TNF-α突

8、變型(MUT)載體進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比較，miR-181a-5p能使WT組載體的熒光強(qiáng)度顯著下降(P＜0.001)。此外，我們對(duì)DCs轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后，發(fā)現(xiàn)DCs內(nèi)TNF-αmRNA的表達(dá)量下調(diào)顯著(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-181a-5p inhibitors后則顯著增強(qiáng)其TNF-αmRNA的表達(dá)(P＜0.001)。
　　結(jié)論:通過(guò)本項(xiàng)研究，我們證實(shí)了外源性HMGB1對(duì)小鼠脾臟D