新型誘導(dǎo)劑鈣離子載體聯(lián)合GM-CSF體外誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞生成樹突狀細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：
　　 1.用組合細(xì)胞因子誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞（human peripheral blood mononuclear cell，PBMC）生成樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）。
　　 2.用新型誘導(dǎo)劑鈣離子載體（CalciumIonophore，CI）A23187聯(lián)合重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）體外誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞生成DC。
　　 3.觀察DC刺激細(xì)胞毒性T淋巴

2、細(xì)胞（CTL）對(duì)K562細(xì)胞（慢性髓性白血病細(xì)胞）產(chǎn)生的特異性殺傷作用。
　　 方法：
　　 試驗(yàn)一：
　　 1.采用密度梯度離心法及黏附法分離出PBMC，加入rhGM-CSF+重組人白介素-4（rhIL-4）誘導(dǎo)，第5天加入重組人腫瘤壞死因子-α（rhTNF-α），繼續(xù)培養(yǎng)2天，刺激DC成熟。
　　 2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量的變化。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的表面標(biāo)志。
　　

3、 4.通過四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測(cè)DC刺激同種異體外周血T淋巴細(xì)胞增殖的能力。
　　 試驗(yàn)二：
　　 1.采用密度梯度離心法及黏附法分離出PBMC，分組培養(yǎng)：
　　 A：傳統(tǒng)方法組，rhGM-CSF+rhIL-4，誘導(dǎo)72h后，加入rhTNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)24h；
　　 B：新型誘導(dǎo)劑組，加入rhGM-CSF+A23187，誘導(dǎo)96h。<

4、br>　　 2.K562細(xì)胞抗原的制備：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞，反復(fù)凍融（-80℃/37℃），低溫離心，取上清用微孔濾膜過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 3.培養(yǎng)開始時(shí)分別予K562細(xì)胞凍融抗原致敏，培養(yǎng)96小時(shí)后分別收集負(fù)載抗原的DC。
　　 4.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量的變化。
　　 5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的表面標(biāo)志。
　　 6.將負(fù)載K562細(xì)胞抗原的DC刺激T淋巴細(xì)胞，通過MTT比色法檢測(cè)

5、各組DC刺激同種異體外周血T淋巴細(xì)胞增殖的能力。
　　 7.通過MTT比色法檢測(cè)各組DC對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用。
　　 8.通過MTT比色法檢測(cè)各組DC激活的CTL對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。
　　 結(jié)果：
　　 試驗(yàn)一：
　　 1.PBMC經(jīng)rhGM-CSF及rhIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后，多數(shù)細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，加入rhTNF-α繼續(xù)培養(yǎng)2天后，可見細(xì)胞有典型的樹枝狀突起并呈散在分布。
　　

6、2.培養(yǎng)第5天時(shí)，DC細(xì)胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分別是（14.3±2.2）％，（12.8±2.1）％，（20.1±1.8）％，（19.9±3.8）％及（16.2±3.3）％。加入TNF-α誘導(dǎo)后，即培養(yǎng)第7天，細(xì)胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分別是（29.8±4.4）％，（18.2±4.5）％，（33.6±4.2）％，（28.1±4.3）％及（8.0±2.8）％（與第5天比較，P值均

7、<0.05）。
　　 3.成熟后的DC具備較強(qiáng)刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，且增殖效應(yīng)隨效靶比的增加而增強(qiáng)。
　　 試驗(yàn)二：
　　 1.A23187聯(lián)合rhGM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC具有典型的樹突形態(tài)。
　　 2.與傳統(tǒng)組比較，新型誘導(dǎo)劑組誘導(dǎo)的DC表面分子表達(dá)水平明顯升高，分別為CD83（45.2±1.8）％vs（16.9±1.3）％；CD1a（31.5±3.9）％ vs（20.4±3.4）％；CD86（4

8、0.1±7.8）％ vs（26.5±2.2）％；CD40（36.4±6.3）％ vs（22.3±3.0）％，P值均<0.05；而CD14表達(dá)明顯下降，分別為（5.7±0.8）％ vs（19.0±1.6）％，P<0.05。
　　 3.采用MTT比色法檢測(cè)各組方法培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)同種異體T淋巴細(xì)胞的刺激作用，發(fā)現(xiàn)兩組 DC在體外均能有效地激發(fā)同種異體外周血 T淋巴細(xì)胞的增殖，與傳統(tǒng)方法相比，新型誘導(dǎo)劑組除效靶比為1：40的增值效應(yīng)與前者

9、相似，P>0.05，其它效靶比均明顯強(qiáng)，P<0.05，且增殖效應(yīng)隨效靶比的增加而增強(qiáng)。
　　 4.與傳統(tǒng)組比較，新型誘導(dǎo)劑組負(fù)載K562凍融抗原后的DC對(duì)K562細(xì)胞抑制作用更明顯，效靶比為1：1及10：1時(shí)，抑瘤率分別為（25.33±3.76）％ vs（15.55±2.39）％、（35.57±5.23）％ vs（22.91±3.21）％，P值均<0.05。
　　 5.與傳統(tǒng)組比較，新型誘導(dǎo)劑組負(fù)載K562凍融抗原后的D

10、C激活的CTL對(duì)K562細(xì)胞有明顯的殺傷作用，效靶比為10：1及40：1時(shí)，殺瘤率分別為（43.33±6.20）％ vs（29.93±2.75）％、（60.97±5.18）％ vs（43.14±4.75）％，P值均<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.組合細(xì)胞因子rhGM-CSF+rhIL-4+rhTNF-α能誘導(dǎo)出成熟的DC，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及費(fèi)用昂貴。
　　 2.新型誘導(dǎo)劑CI A23187聯(lián)合rhGM