雷帕霉素和紫杉醇對(duì)人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞分化成熟和免疫功能的影響研究.pdf

1、目的:近年來認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，炎癥和免疫是致AS發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。最近，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)被發(fā)現(xiàn)存在于正常動(dòng)脈壁中，而在粥樣板塊中數(shù)量明顯增多，說明DC可能在致AS的炎癥反應(yīng)中起重要作用。本研究通過雷帕霉素和紫杉醇對(duì)人單核細(xì)胞源的樹突狀細(xì)胞(DC)的表面標(biāo)志物、成熟和抗原遞層功能、分泌細(xì)胞因子、凋亡的影響，探討雷帕霉素和紫杉醇對(duì)人單核細(xì)胞源的樹突狀細(xì)胞(DC)的分化

2、、成熟及其免疫功能的影響，進(jìn)一步探索雷帕霉素和紫杉醇在動(dòng)脈粥樣硬化免疫炎癥反應(yīng)中的作用。 方法:1.人外周血樹突狀細(xì)胞(DC)培養(yǎng)：取新鮮分離的健康成人外周血白細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液收集單個(gè)核細(xì)胞，再用CD14+磁珠分選出純度大于98％的CD14+單核細(xì)胞，種于含rhGM-CSF(20 ng／ml)、rhIL-4(2ng／ml)、15％胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI1640中，隔天半量換液，，第5天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC(

3、immatureDC，imDC)，加100ng／ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)2天收集起來作為成熟DC(mature DC，mDC)。 　　2.分別用1.0 ug／ml、0.5 ug／ml、0.1 ug／ml的雷帕霉素和100nmol／L、10nmol／L、1nmol／L的紫杉醇和100 ng／ml的LPS加入DC作用24小時(shí)，同時(shí)以只加完全培養(yǎng)基的細(xì)胞做對(duì)照。分別做以下實(shí)驗(yàn)。 3.用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力;E

4、LISA法檢測(cè)上述培養(yǎng)上清液中IL-12、IL-10、TNF-a的含量。 4.DC表型檢測(cè)：收集干預(yù)24小時(shí)的細(xì)胞分別加入單克隆抗人抗體CD1a、CD83、CD86、HLA-DR，孵育30 min，PBS洗2遍，加入FITC熒光標(biāo)的二抗，孵育20 min，PBS洗2遍后懸于熒光標(biāo)記液中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù)。 5.DC吞噬功能的檢測(cè)：收集干預(yù)24小時(shí)的DC，加入1mg／ml的FITC-Dextran在4℃(陰性對(duì)照)或3

5、7℃孵育30min，用含5％FBS的PBS洗滌細(xì)胞2次，最后用200μl的PBS重懸，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值。 6.DC凋亡檢測(cè)：收集干預(yù)24小時(shí)的DC，重懸于500ul的Binding Buffer，再加入5ul Annexin-FITC和5ul Propidium Iodide充分混勻，避光，反應(yīng)10min，在一小時(shí)內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果1.mDC表面CD86、CD83、HLA-DR的表達(dá)較imDC明顯升高，但CD1a無明顯

6、變化；不管是雷帕霉素還是紫杉醇干預(yù)后，imDC細(xì)胞表面分子CD83的表達(dá)與對(duì)照相比沒有明顯差異，但CD1a、CD86、HLA-DR表達(dá)明顯下降(P<0.01)。 2.mDC吞噬能力較imDC明顯下降(P<0.01)；用雷帕霉素和紫杉醇干預(yù)imDC，細(xì)胞的吞噬能力明顯下降(P<0.05)，但兩者比較，下降無明顯差異。 3.在DC與T淋巴細(xì)胞比例為1：5時(shí)，mDC可以產(chǎn)生與對(duì)照有差異的MLR(P<0.01)，紫杉醇和低濃度的

7、雷帕霉素產(chǎn)生與對(duì)照有差異的MLR(P<0.01)。 4.EL ISA細(xì)胞因子定量檢測(cè)表明，mDCs分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和TNF-a明顯高于imDC(P<0.01)；用雷帕霉素和紫杉醇干預(yù)imDC后，IL-10、IL-12和TNF-a明顯低于對(duì)照組(P<0.01)； 5.雷帕霉素、紫杉醇均可以誘導(dǎo)imDC凋亡(P<0.01)，但是雷帕霉素誘導(dǎo)凋亡能力比紫杉醇強(qiáng)，mDC和imDC無明顯差異。 結(jié)論:1、