IL-27促進樹突狀細胞分化成熟及其作用機制的實驗研究.pdf

1、目的：觀察在白介素-27(Interleukin-27，IL-27)單獨作用或與TNF-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的聯(lián)合作用的情況下，對健康成年人外周血單個核細胞(Peripheral blood monocyte，PBMC)來源的樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)分化、成熟和生物學功能的影響，并探討其作用機制。
　　方法：
　　1.采集正常健康人外周血15～20ml，用F

2、icoll-hypaque(葡聚糖-泛影葡胺)密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞，加入基礎(chǔ)細胞因子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor，GM-CSF)和IL-4體外培養(yǎng)5d，得到術(shù)成熟的DC。在第5d時加入刺激因子，并根據(jù)加入刺激因子的不同分為四個實驗組，分別為：陰性對照組(Negative：不加入任何刺激因子)、陽性對照組(TNF-α：20ng/

3、ml)、IL-27組(IL-27:20ng/ml)、TNF-α+IL-27組(即雙細胞因子組，TNF-α：10ng/ml+IL-27:10ng/ml)。
　　2.利用倒置顯微鏡，分別觀察培養(yǎng)至第1d、3d、5d和7d各組末成熟及成熟DC的形態(tài)。
　　3.通過磁珠分選的方法分離符組DC。
　　4.通過流式細胞術(shù)榆測各組DC表面共刺激分子CD1a、CD83和CD80、CD86以及細胞表面粘附分子ICAM-1的表達水平。

4、r>　　5.通過RT-PCR的方法檢測各組DC表面趨化因子受體CCR5、CCR7mRNA的表達情況。
　　6.用MTS的方法檢測各組DC經(jīng)絲裂霉素C處理后，刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力。
　　7.用ELISA的方法檢測各組DC培養(yǎng)上清中細胞因子IL-12、IFN-γ的分泌水平。
　　8.用Western-blot的方法檢測各組DC信號通路蛋白MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3的含量。
　　結(jié)果：<

5、br>　　1.光鏡下，在培養(yǎng)至第5天時，各組細胞形態(tài)均一，呈集落狀生長，體積較小且胞體較圓。培養(yǎng)至第7天時，IL-27組和TNF-α+IL-27組DC呈現(xiàn)典型的成熟形態(tài)學特征，胞體較大，細胞伸出偽足，表現(xiàn)出明顯的毛刺樣結(jié)構(gòu)，與陽性對照TNF-α組相比無明顯差別；而Negative組細胞胞體較小，表面毛刺狀突起較少，無典型DC形態(tài)。
　　2.流式細胞結(jié)果顯示，外周血單個核細胞于體外誘導培養(yǎng)第7d時，Ncgativc組、TNF-α組、

6、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC表面共刺激分子CD1a和CD83雙陽性率分別為23.29±4.49%、42.76±3.50%、35.75±4.10%和52.49±2.65%，CD80和CD86陽性率分別為22.66±3.20%、45.56±2.47%、39.06±1.61%和54.10土0.46%。其中IL-27組與TNF-α組相比CD1a和CD83、CD80和CD86的雙陽性率均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而TNF-α+

7、IL-27組的雙陽性率顯著高于TNF-α組和IL-27組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC表面粘附分子ICAM-1的陽性率分別為為21.84±0.64%、27.66±1.03%、28.47±0.94%、35.11±1.32%，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組的陽性率均高于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而這三組

8、之問ICAM-1的陽性率相比則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示，Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC表面趨化因子受體CCR7 mRNA的表達水平分別為3.09±0.18、4.14±0.08、3.98±0.09、4.75±0.11，其中 TNF-α組、IL-27組和TNI-α+IL-27組CCR7 mRNA的表達水平顯著高于Negative組，統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)各組之間

9、的比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。四組DC表麗CCR5 mRNA的表達水平分別為1.23±0.03、0.86±0.02、0.99±0.03、0.61±0.02，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組 CCR5 mRNA的水平低于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且TNF-α+IL-27組 CCR5mRNA的表達水平與TNF-α組和IL-27組相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而IL-27組

10、與TNF-α組的表達水平無差異(P>0.05)。
　　4.MTS結(jié)果顯示，TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC經(jīng)絲裂霉素C處理后，可明現(xiàn)刺激T細胞增殖。隨DC與T細胞比例增加(1:100、1:50及1:10)，刺激T細胞的能力增強。在DC與T細胞的不同比例下，TNI-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組的刺激作用顯著高于 Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，DC與T淋巴細胞的比

11、例在1:100和1:50時，TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組的吸光度值無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，當 DC與T細胞比例在1:10時，TNF-α+IL-27組吸光度值顯著高于TNF-α組和IL-27紕，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而IL-27組與TNF-α組吸光度位相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　5.ELISA結(jié)果顯示，Negative組、TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC

12、培養(yǎng)上清中細胞因子IL-12的分泌水平分別為37.24±2.34pg/ml、45.83±1.09pg/ml、44.78±0.78pg/ml、49.82±0.76pg/ml，其中 TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組DC培養(yǎng)上清中 IL-12的分泌水平顯著高于Negative組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-27組與TNF-α組、TNF-α+IL-27組的分泌水平相比沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而TNF-α

13、+IL-27組與TNF-α組之間比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IFN-γ在各組的分泌水平分別為666.67±42.28pg/ml、831.90±69.88pg/ml、863.96±37.99pg/ml、1009.09±13.90pg/ml，其中TNF-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組 DC培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平顯著高于Ncgativc組，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-27組與TNF-α組比較分泌水平

14、沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但TNF-α+IL-27組DC IFN-γ的分泌水平較TNF-α組和IL-27組相比則顯著升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.Western-blot結(jié)果顯示，TNr-α組、IL-27組和TNF-α+IL-27組信號通路蛋白MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3水平均有不同程度升高，升高趨勢以TNF-α+IL-27組更為明顯。
　　結(jié)論：
　　1.單獨使用IL-27或

15、與TNF-α協(xié)同作用，可誘導外周血單個核細胞來源的DC成熟。
　　2.經(jīng)過IL-27誘導分化的DC，刺激T淋巴細胞增殖的能力增強，而且在培養(yǎng)上清中，分泌大量的IL-12和IFN-γ，這說明IL-27可以增強DC的生物學功能。
　　3.細胞因子IL-27可以直接或者協(xié)同 TNF-α誘導DC成熟，其機制可能通過活化MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3等信號通路。
　　4.兩種細胞因子聯(lián)合應(yīng)用，減少細胞毒性，增強細