FGFR1對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟與骨吸收功能的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓單核.巨噬細(xì)胞系，多種細(xì)胞因子、激素和轉(zhuǎn)錄因子等通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌的破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)、護(hù)骨素(OPG)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的水平間接調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和骨吸收活性。此外，降鈣素、雌激素和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)等還直接作用于破骨細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路分子的活性來(lái)直接調(diào)控破骨細(xì)胞的分化成熟和骨吸收活性。 FGFs是體內(nèi)重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，己發(fā)現(xiàn)多種FGFs(FGF2、FG

2、F9、FGF18和FGF23)可調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能。FGFs屬于分泌型蛋白分子，生物學(xué)效應(yīng)需通過(guò)細(xì)胞膜上的成纖維生長(zhǎng)因子受體(FGFRs)來(lái)實(shí)現(xiàn)，提示FGFRs參與了破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。FGFR1是破骨細(xì)胞表達(dá)的主要FGFRs，成熟破骨細(xì)胞受FGF2刺激后，出現(xiàn)FGFR1的磷酸化水平上調(diào)，提示FGFR1在破骨細(xì)胞功能的直接調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但缺乏直接證據(jù)。同時(shí)，F(xiàn)GFR1在成骨細(xì)胞中亦大量表達(dá)，已發(fā)現(xiàn)在早期成骨細(xì)胞條件性敲

3、除Fgfrl(用CollgenI-Cre)后會(huì)影響破骨細(xì)胞的分化和活性，提示FGFR1在破骨細(xì)胞功能的間接調(diào)控中也發(fā)揮重要作用，但其分子機(jī)制目前尚不清楚。此外，成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞的能力受其分化程度影響，成年期間骨骼的成骨細(xì)胞以成熟的成骨細(xì)胞、特別是骨細(xì)胞為主，目前不清楚在成熟成骨細(xì)胞表達(dá)的FGFR1是否對(duì)破骨細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。 本課題利用在破骨譜系細(xì)胞和成熟成骨細(xì)胞條件性敲除Fgfrl的小鼠模型并結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討FGFR

4、1對(duì)破骨細(xì)胞的直接、間接調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。主要內(nèi)容包括兩部分：1.通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)探討FGFR1對(duì)破骨細(xì)胞的直接調(diào)控作用及機(jī)制；2.通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討FGFR1對(duì)破骨細(xì)胞的間接調(diào)控作用及機(jī)制。 主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法如下： 第一部分：FGFR1對(duì)破骨細(xì)胞的直接調(diào)控作用及機(jī)制研究 動(dòng)物分組：破骨譜系細(xì)胞條件性Fgfrl敲除小鼠(Lyzs-Cre；Fgfrlf/f)；對(duì)照小鼠(Fgfrlf/f)。 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：

5、 1)通過(guò)X-線攝像、藏紅/固綠(SO/FG)染色，分別在整體水平和組織水平觀察4月齡敲除小鼠和對(duì)照小鼠脛骨骨重建差異；通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測(cè)骨重建過(guò)程中破骨細(xì)胞功能的變化。 2)利用4月齡敲除小鼠和對(duì)照小鼠建立脛骨不穩(wěn)定骨折模型，通過(guò)骨痂組織X-線攝像、SO/FG染色，分別在整體水平和組織水平觀察敲除小鼠和對(duì)照小鼠骨折愈合差異；通過(guò)TRAP染色觀察骨折愈合過(guò)程中破骨細(xì)胞功能的變化。 2.體外

6、實(shí)驗(yàn)： 1)分離6w齡敲除小鼠和對(duì)照小鼠的骨髓單核細(xì)胞，利用RANKL和M-CSF進(jìn)行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化和骨吸收實(shí)驗(yàn)。通過(guò)破骨細(xì)胞TRAP染色計(jì)數(shù)和骨吸收陷窩面積統(tǒng)計(jì)來(lái)觀察破骨細(xì)胞的分化和骨吸收活性。 2)提取誘導(dǎo)培養(yǎng)8d的破骨細(xì)胞總RNA和總蛋白，采用Real-TimePCR和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)破骨細(xì)胞功能分子TRAP、Ctsk和MMP-9的表達(dá)水平及MAPK信號(hào)通路分子(p38、Erk和JNK)活化水平。

7、 第二部分：FGFR1對(duì)破骨細(xì)胞的間接調(diào)控作用及機(jī)制研究 動(dòng)物分組：成熟成骨細(xì)胞條件性敲除小鼠(OC-Cre；Fgfrlf/f)；對(duì)照小鼠(Fgfrlf/f)。 1.成骨細(xì)胞增生凋亡檢測(cè)：利用新生敲除小鼠和對(duì)照小鼠的頭蓋骨分離成骨細(xì)胞，采用計(jì)數(shù)法繪制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，利用TUNEL法檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡。 2.成骨細(xì)胞中與破骨細(xì)胞功能相關(guān)分子檢測(cè)：提取培養(yǎng)第3代成骨細(xì)胞總RNA和總蛋白，利用Real-Time

8、PCR和Westernblot檢測(cè)成骨細(xì)胞中RANKL、OPG和M-CSF的表達(dá)及MAPK信號(hào)通路的活化水平。 3.共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)第3代敲除Fgfrl的成骨細(xì)胞和對(duì)照成骨細(xì)胞分別與野生小鼠骨髓單核細(xì)胞接種于同一培養(yǎng)皿中建立共培養(yǎng)模型。通過(guò)對(duì)共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞TRAP染色計(jì)數(shù)和骨吸收陷窩面積統(tǒng)計(jì)來(lái)觀察共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的分化和骨吸收活性。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、FGFR1通過(guò)上調(diào)破骨細(xì)胞中Erk激酶的活性來(lái)促進(jìn)

9、破骨細(xì)胞的的分化及骨吸收活性 1.4月齡敲除小鼠和對(duì)照小鼠脛骨骨組織形態(tài)無(wú)明顯差異，骨小梁破骨細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)無(wú)明顯變化。骨折修復(fù)觀察則顯示：骨折10d，敲除小鼠和對(duì)照小鼠骨折愈合未見(jiàn)明顯差異。骨折愈合中后期(14d、21d和28d)，敲除小鼠的骨痂x線密度偏低，軟骨痂降解速度慢，骨折線消失遲緩，破骨細(xì)胞數(shù)量與鋪展面積亦明顯低于對(duì)照小鼠(P＜0.05)。提示，F(xiàn)GFR1不影響4月齡小鼠骨重建過(guò)程中破骨細(xì)胞的功能；但破骨譜系細(xì)胞條件

10、性敲除Fgfrl小鼠的骨折愈合延遲，愈合中后期破骨細(xì)胞的分化和活性均受抑制。 2.敲除小鼠骨髓單核細(xì)胞體外RANKL/M-CSF直接誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，骨片上破骨細(xì)胞鋪展不佳，吸收陷窩面積明顯減小(P＜0.05)。分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲除Fgfrl的破骨細(xì)胞中TRAP和MMP-9的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，MAPK信號(hào)通路成員Erk激酶的活化水平明顯下降(P＜0.05)。提示，F(xiàn)GFR1可能通過(guò)上調(diào)破骨

11、細(xì)胞中Erk激酶的活性及破骨細(xì)胞功能分子TRAP和MMP-9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及骨吸收活性。 二、FGFR1通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞中M-CSF、下調(diào)OPG的表達(dá)來(lái)促進(jìn)共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能 敲除Fgfrl的成骨細(xì)胞增生和凋亡明顯加快(P＜0.05)，成骨細(xì)胞中Erk和p38激酶的活性及M-CSF的表達(dá)化顯著下降(P＜0.05)，OPG表達(dá)則明顯上調(diào)(P＜0.05)。在敲除Fgfrl的成骨細(xì)胞與野生小鼠骨

12、髓單核細(xì)胞建立的共培養(yǎng)體系中，破骨細(xì)胞的數(shù)量及骨吸收陷窩面積均明顯小于對(duì)照(P＜0.05)。上述結(jié)果提示：FGFR1抑制成骨細(xì)胞的增生凋亡，上調(diào)成骨細(xì)胞中p38與Erk的活性及M-CSF的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞中OPG的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的分化與骨吸收活性。 主要結(jié)論： 1.4月齡破骨譜系細(xì)胞條件性敲除Fgfrl小鼠骨重建過(guò)程中破骨細(xì)胞功能無(wú)明顯變化；但FGFR1促進(jìn)小鼠骨修復(fù)過(guò)程中破骨細(xì)胞的分化與骨吸收活性