CpG ODN對(duì)人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞分化、成熟及抗腫瘤作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:分離正常人外周血樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC),CpG ODN作為刺激物,探討其對(duì)DC生長(zhǎng)、表面抗原(HLA-DR、CD86)表達(dá)、形態(tài)結(jié)構(gòu)及其誘導(dǎo)DC體外對(duì)T細(xì)胞增殖及殺傷活性的影響;同時(shí)觀察CpG ODN對(duì)腫瘤細(xì)胞上清培養(yǎng)DC的生長(zhǎng)、膜抗原HLA-DR表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,揭示CpG ODN對(duì)DC的免疫激活作用及增強(qiáng)DC抗腫瘤活性的機(jī)制,為CpG ODN可作為免疫佐劑應(yīng)用于體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)提供理論依據(jù).方法:(1)正

2、常人外周血DC的分離與鑒定:按本室常規(guī)分離正常人外周血DC,細(xì)胞懸液涂片經(jīng)S-100蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)DC純度.(2)CpG ODN刺激DC條件的篩選:采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)和方差分析,對(duì)DC培養(yǎng)體系中CpGODN濃度、DC濃度以及培養(yǎng)時(shí)間三因素不同水平進(jìn)行篩選.(3)DC表面分子檢測(cè)及電鏡分析:流式細(xì)胞儀分析CpG ODN最佳條件刺激組、未刺激組DC表面抗原HLA-DR、CD86的表達(dá),采用兩樣本U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;同時(shí)透射電鏡觀察

3、兩組DC的形態(tài)特征.(4)同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR):CpG ODN最佳條件刺激組和未刺激組DC與新鮮分離的同種異體T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),MTT法檢測(cè)并計(jì)算出各組別刺激指數(shù)(SI),利用Excel軟件分析CpG ODN刺激后DC對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)作用.(5)抗腫瘤實(shí)驗(yàn):采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì),探討CpG ODN對(duì)DC調(diào)節(jié)T細(xì)胞殺傷腫瘤活性的影響.(6)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)DC的影響:收集胰腺癌細(xì)胞(ASPC-Ⅰ)培養(yǎng)上清,以不同濃度與DC共培養(yǎng)

4、,MTT法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間的各孔光吸收值(A<,490>);流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞上清培養(yǎng)和正常未用腫瘤細(xì)胞上清培養(yǎng)DC的表型.(7)CpG ODN對(duì)腫瘤細(xì)胞上清培養(yǎng)DC的作用:實(shí)驗(yàn)分3組:①1μmol.1<'-1>CpG ODN組;②含30％ASPC-Ⅰ培養(yǎng)上清液組;③1 μ mol.1<'-1>CpG ODN+含30％ASPC-Ⅰ培養(yǎng)上清液組,各組分另與DC共培養(yǎng)72h,流式細(xì)胞儀分析各組DC表型,MTT法檢測(cè)各組光吸收值(A<,4

5、90>).結(jié)論:(1) CpG ODN可誘導(dǎo)人外周血DC分化、成熟,增強(qiáng)DC調(diào)節(jié)T細(xì)胞殺傷腫瘤的活性.(2)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制DC的生長(zhǎng)和表面抗原的表達(dá).(3)CpG ODN可拮抗腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)DC生長(zhǎng)的抑制及表面抗原表達(dá)的下調(diào).(4)上述結(jié)果顯示,CpG ODN對(duì)DC具有較強(qiáng)的免疫激活作用,對(duì)體外誘導(dǎo)DC及腫瘤環(huán)境DC作用效果均顯著,表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫佐劑功能,為其應(yīng)用于體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)提供了理論依據(jù),其確切的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究