cpg odn增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞增殖周期與凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、我們的宗旨是：致力于成為醫(yī)務(wù)工作者晉升、考試的心靈導(dǎo)師；CpGCpGODNODN增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞增殖周期和凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞增殖周期和凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究作者：孫梯業(yè)顏偉劉全達(dá)張娜賈洪琳段偉宏周寧新作者單位：100088北京，第二炮兵總醫(yī)院肝膽胃腸病研究所(孫梯業(yè)、劉全達(dá)、賈洪琳、段偉宏、周寧新)空軍總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部(顏偉、張娜)【摘要】目的探討CpGODN1826增強(qiáng)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)抗胃癌效應(yīng)的作用。方法分

2、離正常人外周血DC，用GMCSF和IL4培養(yǎng)，于第5天加入TNFα并分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組繼續(xù)培養(yǎng)。第6天各組均加入胃癌細(xì)胞凍融抗原50μl，Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ組再分別加入CpGODN182610μgml，第10天ELISA檢測(cè)IL12和IFNγ的水平，MTT法檢測(cè)CTL對(duì)MKN45、MKN28、SGC7901和A549細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CpGODN1826增強(qiáng)DC對(duì)胃癌細(xì)胞增殖周期、凋亡的影響。結(jié)果體外培養(yǎng)第

3、10天，加入CpGODN1826后各組IL12、IFNγ的分泌量明顯提高CpGODN1826協(xié)助DC對(duì)同種不同分化類型的胃癌細(xì)胞株MKN45、MKN28、SGC7901均有強(qiáng)烈的殺傷效應(yīng)(P0.01)，殺傷活性顯著高于A549(P0.01)。體外應(yīng)用CpGODN1826對(duì)腫瘤細(xì)胞周期比例：G0G1間期(MKN4568.35%、MKN2869.23%、SGC790169.80%)，S期(MKN4539.45%、MKN2839.75%、SG

4、C790139.55%)，G2M期(MKN456.50%、MKN286.30%、SGC79016.42%)與A549(G0G1間期57.68%，S期25.13%，G2M期18.46%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)同時(shí)，不同腫瘤細(xì)胞株的凋亡率分別為MKN4575.20%、MKN2373.87%、SGC790172.43%、A54951.43%，表明CpGODN1826能顯著增強(qiáng)DC對(duì)胃癌細(xì)胞周期的抑制作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的早期凋亡(

5、P0.01)。結(jié)論CpGODN1826體外可顯著增強(qiáng)DC誘導(dǎo)出高效而特異的抗胃癌效應(yīng)，顯著抑制胃癌細(xì)胞分裂增殖、促進(jìn)凋亡，可作為胃癌免疫治療的一種有效方法?！娟P(guān)鍵詞】胃腫瘤樹(shù)突細(xì)胞細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡CpGODN【Abstract】ObjectiveToexplewhetherCpGODN1826assistdendriticcells(DC)toaffecttheantigastriccancereffectsinvitro.Method

6、sDCwasisolatedfromnmalhumanperipheralbloodbyGMCSFIL4，appendTNFαinthefifthdividedⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷgroups，appendcarcinomaantigen50μlineverygroup，CpGODN182610μgmlinⅡ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅷgroupsinthesixthday.IL12IFNγlevelsweredetectedusingELI

7、SAin10thday.ThecytotoxicityofCTLtoMKN45，MKN28，SGC7901，A549wasdetectedbyMTTassayinvitro.TheinhibitiveeffectsofCpGODN1826ongastriccellproliferationcycleapoptosisinvitroweredetectedbyflowcytometry.ResultsOnthe10thday，IL12，I

8、FNγlevelweresignificantlyincreasedintheCpGODN1826groups.TheCTLhadmuchobviouslyraisedthecytotoxicitytodifferentdifferentiatedtypesofthethreegastriccancercelllinessuchMKN45，MKN28，SGC7901byCpGODN1826，thanA549(P0.01).Treated

9、withtheCpGODN1826invitro，thepercentagesofG0G1，SG2Mcellsoftumcellswere(MKN4568.35%，MKN2869.23%，SGC790169.80%)，(MKN4539.45%，MKN2839.75%，SGC790139.55%)(MKN456.50%，MKN286.30%，SGC79016.42%)respectively.theapoptosisofMKN4575.2

10、0%，MKN2373.87%，SGC790172.43%，A54951.43%，indicatedCpGODN1826maysignificantlyinhibitthepercentagesofthreegastriccelllines，promotegastriccellearlyapoptosis(P0.01).ConclusionsTheeffeciencespecificityofCpGODN1826canobservably

11、enhancedendriticcellsinducetheeffeciencespecificityofantigastriccanceractivity，cansignificantlyinhibitgastriccellsproliferationgrowth，promotegastriccellearlyapoptosis，mightprovideanewkindoftherapeuticmeansfgastric我們的宗旨是：

12、致力于成為醫(yī)務(wù)工作者晉升、考試的心靈導(dǎo)師；各組效應(yīng)細(xì)胞同各組靶細(xì)胞100μl在96孔板中混合，即效應(yīng)細(xì)胞∶淋巴細(xì)胞=40∶1，在37℃CO2溫箱中培養(yǎng)4h后。設(shè)各組空白對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)4h后細(xì)胞貼壁，每孔中加入5mgml的MTT20μl，置37℃CO2溫箱培養(yǎng)4h后取出，每組前3個(gè)復(fù)孔分別加入20μl新鮮配制的MTT溶液(5mgml)，繼續(xù)孵育4h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩

13、10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光(absption，A)值，計(jì)算細(xì)胞殺傷活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。剩余復(fù)孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至第10天進(jìn)行IFNγ、IL12和相關(guān)檢測(cè)。殺傷活性=1[實(shí)驗(yàn)組A值(效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組A值靶細(xì)胞對(duì)照組A值)]100%。5.IFNγ、IL12的檢測(cè)：取上述體外誘導(dǎo)培養(yǎng)至第10天的CTLs細(xì)胞上清液每孔100μl，按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定IFNγ和IL12的含量。6.外周血T淋巴細(xì)胞

14、獲?。河昧馨图?xì)胞分離液分離獲取PBMC，制備尼龍毛柱，1109PBMC重懸于2mlRPMI1640培養(yǎng)基中，將均勻細(xì)胞懸液裝入尼龍毛柱，關(guān)閉閥門置37℃孵育60min37℃預(yù)溫、含20%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗脫毛柱2次，獲取T淋巴細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞比例。7.細(xì)胞周期檢測(cè)：收集培養(yǎng)至第10天的剩余復(fù)孔腫瘤細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，1500rmin離心10min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105ml置于6

15、孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為210537℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)20h。以4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，1500rmin離心5min，重復(fù)兩次，棄上清，以0.5ml預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，加入3000活性單位的RNaseA37℃水浴30min冰浴降溫，終止RNaseA的作用后，加入碘化丙碇染液0.5ml染色30min，樣品置于暗處備用檢測(cè)前用400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去雜質(zhì)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1107個(gè)ml488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定樣品，620nm帶通濾片檢測(cè)P

16、I熒光。每樣本收集多于10000個(gè)熒光信號(hào)，采用MultiCycleDNA軟件分析細(xì)胞周期分布情況，計(jì)算細(xì)胞分裂增殖指數(shù)(ProliferationIndex，PI)。PI=[S%G2M%(G0G1S%G2M%)]100%。8.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：收集培養(yǎng)至第10天的剩余復(fù)孔腫瘤細(xì)胞，以0.25%胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，1500rmin離心10min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105ml置于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為210537℃、5%CO2條

17、件下，培養(yǎng)20h。以4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，1500rmin離心5min，重復(fù)2次，棄上清，以0.5ml4℃PBS重懸細(xì)胞后，移至EP管中，再次1500rmin離心5min加5μlAnnexinⅤFITC溶液和2.5μl碘化丙啶染液到100μl細(xì)胞混懸液中，混合后室溫避光反應(yīng)30min，加入反應(yīng)緩沖液400μl，送檢。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)及單因素方

18、差分析，P0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.CpGODN1826誘導(dǎo)DC對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：胃癌抗原致敏DC誘導(dǎo)的特異性CTLs對(duì)分化不同的同種胃癌細(xì)胞株MKN45(Ⅰ組)、MKN28(Ⅲ組)和SGC7901(Ⅴ組)均有較高的殺傷率，對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的殺傷率較低，MKN45、MKN28和SGC7901與A549(Ⅶ組)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)，說(shuō)明胃癌致敏DC誘導(dǎo)的CTLs對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷活性

19、具有較強(qiáng)的特異性，而對(duì)A549沒(méi)有特異性的殺傷作用(表1)。而CpGODN1826可明顯提高胃癌抗原致敏DC誘導(dǎo)的特異性CTLs對(duì)分化不同的同種胃癌細(xì)胞株MKN45(Ⅱ組)、MKN28(Ⅳ組)和SGC7901(Ⅵ組)的殺傷率，對(duì)A549(Ⅷ組)的殺傷率較高，Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組與Ⅷ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)，說(shuō)明CpGODN1826能顯著增強(qiáng)DC的特異性殺傷作用，對(duì)A549也有較高的殺傷率(表2)。表1DC誘導(dǎo)CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞