cpg odn增強樹突狀細胞對胃癌細胞增殖周期與凋亡影響的實驗研究

1、我們的宗旨是：致力于成為醫(yī)務工作者晉升、考試的心靈導師；CpGCpGODNODN增強樹突狀細胞對胃癌細胞增殖周期和凋亡影響的實驗研究增強樹突狀細胞對胃癌細胞增殖周期和凋亡影響的實驗研究作者：孫梯業(yè)顏偉劉全達張娜賈洪琳段偉宏周寧新作者單位：100088北京，第二炮兵總醫(yī)院肝膽胃腸病研究所(孫梯業(yè)、劉全達、賈洪琳、段偉宏、周寧新)空軍總醫(yī)院醫(yī)務部(顏偉、張娜)【摘要】目的探討CpGODN1826增強樹突狀細胞(DC)抗胃癌效應的作用。方法分

2、離正常人外周血DC，用GMCSF和IL4培養(yǎng)，于第5天加入TNFα并分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ組繼續(xù)培養(yǎng)。第6天各組均加入胃癌細胞凍融抗原50μl，Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ組再分別加入CpGODN182610μgml，第10天ELISA檢測IL12和IFNγ的水平，MTT法檢測CTL對MKN45、MKN28、SGC7901和A549細胞的體外殺傷效應。流式細胞術檢測CpGODN1826增強DC對胃癌細胞增殖周期、凋亡的影響。結果體外培養(yǎng)第

3、10天，加入CpGODN1826后各組IL12、IFNγ的分泌量明顯提高CpGODN1826協(xié)助DC對同種不同分化類型的胃癌細胞株MKN45、MKN28、SGC7901均有強烈的殺傷效應(P0.01)，殺傷活性顯著高于A549(P0.01)。體外應用CpGODN1826對腫瘤細胞周期比例：G0G1間期(MKN4568.35%、MKN2869.23%、SGC790169.80%)，S期(MKN4539.45%、MKN2839.75%、SG

4、C790139.55%)，G2M期(MKN456.50%、MKN286.30%、SGC79016.42%)與A549(G0G1間期57.68%，S期25.13%，G2M期18.46%)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)同時，不同腫瘤細胞株的凋亡率分別為MKN4575.20%、MKN2373.87%、SGC790172.43%、A54951.43%，表明CpGODN1826能顯著增強DC對胃癌細胞周期的抑制作用，促進胃癌細胞的早期凋亡(

5、P0.01)。結論CpGODN1826體外可顯著增強DC誘導出高效而特異的抗胃癌效應，顯著抑制胃癌細胞分裂增殖、促進凋亡，可作為胃癌免疫治療的一種有效方法?！娟P鍵詞】胃腫瘤樹突細胞細胞周期細胞凋亡CpGODN【Abstract】ObjectiveToexplewhetherCpGODN1826assistdendriticcells(DC)toaffecttheantigastriccancereffectsinvitro.Method

6、sDCwasisolatedfromnmalhumanperipheralbloodbyGMCSFIL4，appendTNFαinthefifthdividedⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷgroups，appendcarcinomaantigen50μlineverygroup，CpGODN182610μgmlinⅡ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅷgroupsinthesixthday.IL12IFNγlevelsweredetectedusingELI

7、SAin10thday.ThecytotoxicityofCTLtoMKN45，MKN28，SGC7901，A549wasdetectedbyMTTassayinvitro.TheinhibitiveeffectsofCpGODN1826ongastriccellproliferationcycleapoptosisinvitroweredetectedbyflowcytometry.ResultsOnthe10thday，IL12，I

8、FNγlevelweresignificantlyincreasedintheCpGODN1826groups.TheCTLhadmuchobviouslyraisedthecytotoxicitytodifferentdifferentiatedtypesofthethreegastriccancercelllinessuchMKN45，MKN28，SGC7901byCpGODN1826，thanA549(P0.01).Treated

9、withtheCpGODN1826invitro，thepercentagesofG0G1，SG2Mcellsoftumcellswere(MKN4568.35%，MKN2869.23%，SGC790169.80%)，(MKN4539.45%，MKN2839.75%，SGC790139.55%)(MKN456.50%，MKN286.30%，SGC79016.42%)respectively.theapoptosisofMKN4575.2

10、0%，MKN2373.87%，SGC790172.43%，A54951.43%，indicatedCpGODN1826maysignificantlyinhibitthepercentagesofthreegastriccelllines，promotegastriccellearlyapoptosis(P0.01).ConclusionsTheeffeciencespecificityofCpGODN1826canobservably

11、enhancedendriticcellsinducetheeffeciencespecificityofantigastriccanceractivity，cansignificantlyinhibitgastriccellsproliferationgrowth，promotegastriccellearlyapoptosis，mightprovideanewkindoftherapeuticmeansfgastric我們的宗旨是：

12、致力于成為醫(yī)務工作者晉升、考試的心靈導師；各組效應細胞同各組靶細胞100μl在96孔板中混合，即效應細胞∶淋巴細胞=40∶1，在37℃CO2溫箱中培養(yǎng)4h后。設各組空白對照，所有實驗組均設5個復孔，標準條件下培養(yǎng)4h后細胞貼壁，每孔中加入5mgml的MTT20μl，置37℃CO2溫箱培養(yǎng)4h后取出，每組前3個復孔分別加入20μl新鮮配制的MTT溶液(5mgml)，繼續(xù)孵育4h，吸出孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩

13、10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光(absption，A)值，計算細胞殺傷活性，實驗重復3次。剩余復孔細胞繼續(xù)培養(yǎng)至第10天進行IFNγ、IL12和相關檢測。殺傷活性=1[實驗組A值(效應細胞對照組A值靶細胞對照組A值)]100%。5.IFNγ、IL12的檢測：取上述體外誘導培養(yǎng)至第10天的CTLs細胞上清液每孔100μl，按ELISA檢測試劑盒說明測定IFNγ和IL12的含量。6.外周血T淋巴細胞

14、獲?。河昧馨图毎蛛x液分離獲取PBMC，制備尼龍毛柱，1109PBMC重懸于2mlRPMI1640培養(yǎng)基中，將均勻細胞懸液裝入尼龍毛柱，關閉閥門置37℃孵育60min37℃預溫、含20%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基洗脫毛柱2次，獲取T淋巴細胞，臺盼藍染色檢測活細胞比例。7.細胞周期檢測：收集培養(yǎng)至第10天的剩余復孔腫瘤細胞，以0.25%胰酶消化后，制成單細胞懸液，1500rmin離心10min，棄上清，調整細胞濃度為1105ml置于6

15、孔板中，每孔細胞數(shù)為210537℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)20h。以4℃預冷的PBS洗滌細胞，1500rmin離心5min，重復兩次，棄上清，以0.5ml預冷的PBS重懸細胞，加入3000活性單位的RNaseA37℃水浴30min冰浴降溫，終止RNaseA的作用后，加入碘化丙碇染液0.5ml染色30min，樣品置于暗處備用檢測前用400目尼龍網(wǎng)過濾除去雜質，調整細胞濃度為1107個ml488nm激發(fā)波長測定樣品，620nm帶通濾片檢測P

16、I熒光。每樣本收集多于10000個熒光信號，采用MultiCycleDNA軟件分析細胞周期分布情況，計算細胞分裂增殖指數(shù)(ProliferationIndex，PI)。PI=[S%G2M%(G0G1S%G2M%)]100%。8.細胞凋亡檢測：收集培養(yǎng)至第10天的剩余復孔腫瘤細胞，以0.25%胰酶消化后，制成單細胞懸液，1500rmin離心10min，棄上清，調整細胞濃度為1105ml置于6孔板中，每孔細胞數(shù)為210537℃、5%CO2條

17、件下，培養(yǎng)20h。以4℃預冷的PBS洗滌細胞，1500rmin離心5min，重復2次，棄上清，以0.5ml4℃PBS重懸細胞后，移至EP管中，再次1500rmin離心5min加5μlAnnexinⅤFITC溶液和2.5μl碘化丙啶染液到100μl細胞混懸液中，混合后室溫避光反應30min，加入反應緩沖液400μl，送檢。三、統(tǒng)計學分析所得數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差(xs)表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，均數(shù)的比較用t檢驗及單因素方

18、差分析，P0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。結果1.CpGODN1826誘導DC對腫瘤細胞的殺傷作用：MTT檢測結果顯示：胃癌抗原致敏DC誘導的特異性CTLs對分化不同的同種胃癌細胞株MKN45(Ⅰ組)、MKN28(Ⅲ組)和SGC7901(Ⅴ組)均有較高的殺傷率，對肺癌細胞株A549的殺傷率較低，MKN45、MKN28和SGC7901與A549(Ⅶ組)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)，說明胃癌致敏DC誘導的CTLs對胃癌細胞的殺傷活性

19、具有較強的特異性，而對A549沒有特異性的殺傷作用(表1)。而CpGODN1826可明顯提高胃癌抗原致敏DC誘導的特異性CTLs對分化不同的同種胃癌細胞株MKN45(Ⅱ組)、MKN28(Ⅳ組)和SGC7901(Ⅵ組)的殺傷率，對A549(Ⅷ組)的殺傷率較高，Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅵ組與Ⅷ組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)，說明CpGODN1826能顯著增強DC的特異性殺傷作用，對A549也有較高的殺傷率(表2)。表1DC誘導CTLs對腫瘤細胞