負(fù)載凋亡的肺腺癌細(xì)胞致樹(shù)突狀細(xì)胞成熟并增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用研究.pdf

1、本文研究目的：采用凋亡(1.33μmol/L順鉑所致)以及(熱休克、反復(fù)凍融和5.32μmol/L順鉑所致)壞死的肺腺癌A549細(xì)胞作為腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)，分別刺激人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC(monocyte-derived DC，mo-DC)；通過(guò)比較凋亡和壞死的A549細(xì)胞對(duì)mo-DC表型、超微結(jié)構(gòu)和白介素(interleukin，IL)-12分泌量的影響，來(lái)評(píng)估二者對(duì)誘導(dǎo)mo-

2、DC成熟能力的影響，同時(shí)觀察凋亡的肺腺癌A549細(xì)胞所誘導(dǎo)成熟的mo-DC(A-DC)對(duì)NK細(xì)胞殺傷能力的影響。 研究材料與方法： 體外誘導(dǎo)DC，并用不同實(shí)驗(yàn)條件下所得的TAA負(fù)載于DC；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定DC表面標(biāo)志，電鏡觀察DC形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，ELISA法測(cè)定IL-12分泌量；流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色判定A549細(xì)胞凋亡；4h-<'51>Cr釋放法測(cè)定A-DC對(duì)CD56+NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞能力的影響。：

3、 研究結(jié)果： (1)順鉑濃度為1.33μmol/L時(shí)，A549細(xì)胞凋亡率可達(dá)19.7％，細(xì)胞大多被阻滯在G1期；順鉑濃度為5.44μmol/L時(shí)，A549細(xì)胞幾乎全部死亡。 (2)掃描電鏡下可見(jiàn)DC伸展出大量大小不一、扁平的胞質(zhì)突起，其末端圓鈍且細(xì)胞膜光滑無(wú)皺折。成熟的DC(mature DC，mDC)于不成熟的DC(immature DC，iDC)，但表面突起較iDC減少。 (3)透射電鏡下可見(jiàn)DC的胞體周圍

4、有不規(guī)則突起和褶皺；胞核染色深，偏向一側(cè)，形狀不規(guī)則，多為分葉狀，內(nèi)異染色質(zhì)沿核邊高度凝聚；胞質(zhì)線粒體較為豐富，較多吞飲大泡及小泡。mDC胞體周圍突起較iDC減少。 (4)人DC特異性表面標(biāo)志CDla為68.7％。不同實(shí)驗(yàn)條件(L-DC、H-DC、A-DC和N-DC)刺激下DC的表面標(biāo)志HLA-DR分別為6.98％、34.12％、39.49％、19.13％，CDS0分別為11.2％、40.55％、54.33％、49.76％。A-

5、DC的表面標(biāo)志HLA-DR顯著高于L-DC和N-DC的表達(dá)(P<0.01)，但與H-DC表達(dá)相近(P>0.05)；A-DC與N-DC表面均高表達(dá)CD80，雖然前者略高于后者，但二者間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 (5)DC和L-DC僅能分泌少量IL-12，其細(xì)胞上清液濃度低于20 pg·ml<'-><'；1>；H-DC、N-DC和A-DC分泌IL-12的能力增強(qiáng)，其細(xì)胞上清液濃度分別為(201.5±30.3)、(41.2±5.

6、9)和(289.7±45.2)Pg·ml<'-1>。N-DC的IL-12分泌量較DC和L-DC有增加，H-DC和A-DC的IL-12分泌量均明顯增加，與其余各組間有顯著性差異(P<0.01)，其中尤以A-DC的IL-12分泌量最高，與H-DC間差異顯著(P<0.05)。 (6)與NK細(xì)胞對(duì)K562的裂解能力比較，DC和A-DC均能使NK細(xì)胞對(duì)K562的殺傷能力增強(qiáng)，而且差異顯著(P<0.01)：在DC作用下，當(dāng)效靶比(effec

7、tor：target，E：T)為5、10和20時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂解率分別為(3.7±0.96)％、(18.33±2.29)％和(46.8±3.39)％；在A-DC作用下，E：T為5、10和20時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力進(jìn)一步增加，其裂解率分別為(13.33±0.76)％、(33.67±1.19)％和(55.87±2.50)％。 (7)當(dāng)A-DC的上清液加入NK細(xì)胞時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力顯著增加

8、，如E：T為20時(shí)，K562細(xì)胞裂解率為(45.73±0.06)％，而未加A-DC時(shí)K562細(xì)胞裂解率(10.7±0.529)％(P<0.01)。 (8)當(dāng)E：T為20時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂解率是(47.1±0.96)％；加入干擾素(interferon，IFN)<,-γ>后，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂解率是(46.9±4.85)％，與NK細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)；加入IL-12后，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂

9、解率是(61.1±1.57)％，與另外二組差異顯著(P<0.01)。 (9)當(dāng)E：T為20時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂解率是(19.2±0.82)％；加入A-DCsup后，NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂解率是(48.9±3.84)％，與NK細(xì)胞對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。加入IFN-γab后，A-DCsup作用下的NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的裂解率是(45.3±1.31)％，與A-DCsup組無(wú)顯著差異(P>0.05)；加入IL-