hTERT與HSP70融合蛋白的構(gòu)建及其對(duì)DC分化成熟作用的研究.pdf

1、20世紀(jì)70年代以來，惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率一直呈上升趨勢(shì)，在我國農(nóng)村與城市，已成為居民死亡首要原因。目前治療惡性腫瘤的方法主要有手術(shù)治療、化療和放療，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫治療已成為研究的熱點(diǎn)。本研究擬構(gòu)建熱休克蛋白融合蛋白疫苗，并進(jìn)一步研究該蛋白負(fù)載DC細(xì)胞后，對(duì)DC的影響。 目的:構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶與熱休克蛋白70融合基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21進(jìn)行表達(dá)和純化。初步研究融合蛋白對(duì)DC分化成熟的作用。

2、 方法:利用PCR方法擴(kuò)增hTERT基因片段(532aa～637aa)和HSP70全長cDNA，酶切后分別插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a，形成pET-32a-hTERT和pET-32a-HSP70；然后雙酶切后者，得到HSP70片段，將其插入前者h(yuǎn)TERT的3’端，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-hTERT-HSP70。經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序后，將pET-32a-HSP70和pET-32a-hTERT-HSP70轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行誘

3、導(dǎo)表達(dá)和分離純化。融合蛋白負(fù)載DC后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)。 結(jié)果:測(cè)序結(jié)果表明成功的構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET-32a-HSP70和pET32a-hTERT-HSP70。含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)后分別表達(dá)約90kD和110kD的蛋白，經(jīng)純化后成功得到帶組氨酸標(biāo)簽的可溶性目的蛋白。經(jīng)HSP70、hTERT-HSP70融合蛋白誘導(dǎo)的DC細(xì)胞，表面分子CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)上調(diào)，而CD14表達(dá)