活性氧與SLE外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、抗原遞呈能力的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)、多器官、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、病程遷延反復(fù)的自身免疫性疾病，對(duì)患者的身心健康造成較大危害，是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。盡管SLE的發(fā)病機(jī)制未完全闡明，但已有的證據(jù)表明，疾病的發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素相關(guān)，引起機(jī)體免疫異常，尤其是免疫細(xì)胞表達(dá)和（或）功能紊亂：如對(duì)自身抗原的耐受失衡，自身反應(yīng)性的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化紊亂，細(xì)

2、胞因子功能發(fā)揮失控以及針對(duì)抗雙鏈DNA、核小體、核蛋白的自身抗體過度產(chǎn)生。由此導(dǎo)致的自身反應(yīng)性抗體大量聚集會(huì)引起補(bǔ)體活化、免疫復(fù)合物沉積，最終引起組織和（或）器官損傷。
　　樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）廣泛表達(dá)于體內(nèi)，通常起著免疫監(jiān)視、抗原遞呈和免疫耐受的作用。DC作為特殊的“哨兵細(xì)胞”，在固有免疫與適應(yīng)性免疫間起著重要的橋梁作用。DC表達(dá)特殊的模式識(shí)別受體，如Toll樣受體，C型凝集素受體，RIG-I樣受體以

3、及 NOD樣受體。DC通常可以分為兩大類：漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid DC,pDC）和常規(guī)樹突狀細(xì)胞（conventional DC，cDC）。DC的模式識(shí)別受體通過結(jié)合到微生物的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern molecules，PAMPs）或者內(nèi)源性分子的損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern molec

4、ules，DAMPs），以捕獲抗原。當(dāng)DC成功捕獲抗原后，DC將歷經(jīng)成熟：（1）上調(diào)表面分子和共刺激分子的表達(dá)；（2）啟動(dòng)和調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能；（3）分泌一些細(xì)胞因子，從而調(diào)控和極化其他效應(yīng)分子的功能。DC可以通過幾種方式影響SLE的發(fā)病，如遞呈自身抗原給自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。SLE與MHC單倍體顯著相關(guān)，表明T淋巴細(xì)胞應(yīng)答在疾病的形成中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)狼瘡鼠體內(nèi)TLR7過表達(dá)會(huì)加劇疾病的發(fā)生、

5、發(fā)展，這一過程與固有刺激啟動(dòng)相關(guān)，并且完全依賴于MHC單倍型，提示DC可能參與了遞呈染色質(zhì)和RNA相關(guān)的蛋白質(zhì)給自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞?；罨腸DC能產(chǎn)生IL-12p70，而IL-12p70會(huì)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞中IFNγ的形成，這將導(dǎo)致初始T淋巴細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞；pDC能產(chǎn)生I型干擾素，而I型干擾素會(huì)促進(jìn)cDC成熟，降低使Toll樣受體活化的閾值。因此，DC在SLE發(fā)病中可以通過影響炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生而起作用。
　　活性氧（rea

6、ctive oxygen species,ROS）包括很多分子實(shí)體，如非自由基氧化劑H2O2，NO衍生的過氧亞硝酸鹽，或者含未成對(duì)電子的自由基，如羥基自由基、NO和超氧。細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶在受到外界刺激后會(huì)產(chǎn)生ROS，胞內(nèi)物質(zhì)如過氧化物酶和線粒體在氧代謝時(shí)所產(chǎn)生的生化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生ROS。已有研究表明，ROS對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮直接作用，從而對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分化和凋亡產(chǎn)生重要影響。ROS能夠誘導(dǎo)DC成熟，影響DC分泌促炎性細(xì)胞因子。DC內(nèi)

7、含有像NADPH氧化酶那樣發(fā)揮作用所需的物質(zhì)。當(dāng) DC與微生物成分或同源 T淋巴細(xì)胞相互作用時(shí)，DC產(chǎn)生ROS。因此，ROS可能作為DC的內(nèi)源性調(diào)節(jié)體影響DC的功能發(fā)揮。
　　已有報(bào)道，ERK（extracellular regulated protein kinases）通路是MAPK通路中高度保守的通路，參與了多種細(xì)胞功能的發(fā)揮。ERK及其磷酸化的形態(tài)、ROS在SLE中表達(dá)異常，與疾病活動(dòng)度相關(guān)，但現(xiàn)有的研究并未揭示單核細(xì)胞來

8、源的樹突狀細(xì)胞（monocytes-induced dendritic cells，moDC）中磷酸化的ERK（phosphorylation of ERK，pERK）、ROS表達(dá)是否異常，moDC分泌的炎癥性細(xì)胞因子是否異常，pERK的表達(dá)是否與ROS相關(guān)，炎癥性細(xì)胞因子的分泌是否與ROS相關(guān)，ROS會(huì)否經(jīng)pERK通路影響炎癥性細(xì)胞因子的分泌。此外，本研究將探討moDC的抗原遞呈能力，以Th17細(xì)胞分化為例，推測(cè)其抗原遞呈能力是否改變

9、，且是否與ROS相關(guān)。這些研究將增進(jìn)對(duì)moDC內(nèi)ROS表達(dá)和（或）功能的了解。
　　第一部分 SLE患者外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)研究
　　目的：
　　從人外周血中提取出單核細(xì)胞誘導(dǎo)成樹突狀細(xì)胞后，比較SLE患者（新發(fā)病例，病情穩(wěn)定期病例）和正常對(duì)照的樹突狀細(xì)胞內(nèi) ROS表達(dá)水平差異，以探索 ROS與SLE之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法：
　　在獲取研究對(duì)象知情同意后采用自行設(shè)計(jì)的問卷進(jìn)行調(diào)查，同時(shí)

10、抽取15ml抗凝外周靜脈血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分選出外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過磁珠分選的方法提取出單核細(xì)胞，經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑（rhGM-CSF+rhIL-4）培養(yǎng)7天，測(cè)定moDC內(nèi)ROS表達(dá)水平：收集SLE病例20例（新發(fā)病例11例，病情穩(wěn)定期病例9例），健康對(duì)照20例；病例和對(duì)照組各分為L(zhǎng)PS刺激組和未刺激組?；驈娜送庵苎蟹蛛x出單核細(xì)胞后，經(jīng)含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，測(cè)定moDC內(nèi)ROS表達(dá)水平：收集SLE病例10例（新發(fā)病例5

11、例，病情穩(wěn)定期病例5例），健康對(duì)照10例；病例和對(duì)照組各分為L(zhǎng)PS刺激組和未刺激組。采用SPSS10.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。病例與對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)，符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者采用Man-Whitney U檢驗(yàn)。以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑（rhGM-CSF+rhIL-4）培養(yǎng)moDC時(shí)：20例SLE病例均為女性；20例健康對(duì)照中，女性19例、

12、男性1例。病例組平均年齡為32.0±7.9歲（年齡分布從20到44歲）；健康對(duì)照組平均年齡為34.1±12.8歲（年齡分布從22到59歲）。
　?、俳】祵?duì)照與病情穩(wěn)定期病例做比較時(shí)，moDC未經(jīng)LPS刺激，ROS表達(dá)水平在兩者間比較的P=0.402；moDC經(jīng)LPS刺激時(shí)，P=0.566。
　?、诮】祵?duì)照與新發(fā)病例做比較時(shí)，moDC未經(jīng)LPS刺激，ROS表達(dá)水平在兩者間比較的P=0.358；moDC經(jīng)LPS刺激時(shí)，P=0.6

13、70。
　　③不考慮疾病活動(dòng)度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體，與健康對(duì)照做比較時(shí)，moDC未經(jīng)LPS刺激，ROS表達(dá)水平在兩者間比較的P=0.194；moDC經(jīng)LPS刺激時(shí)，P=0.646。
　?、芸紤]LPS刺激前后對(duì)健康對(duì)照或SLE病例自身moDC的影響：健康對(duì)照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/病情穩(wěn)定期病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平，與健康對(duì)照經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/病情穩(wěn)定期病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)

14、水平做比較，即健康對(duì)照與病情穩(wěn)定期病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較，P=0.441；健康對(duì)照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/新發(fā)病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平，與健康對(duì)照經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/新發(fā)病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平做比較，即健康對(duì)照與新發(fā)病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較，P=0.075。不考慮疾病活動(dòng)度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體：健康對(duì)照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/SLE病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平

15、，與健康對(duì)照經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/SLE病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平做比較，即所有健康對(duì)照與所有SLE病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較，P=0.062。
　?。?）經(jīng)含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)moDC時(shí)：10對(duì)SLE病例和健康對(duì)照中，女性均為9例、男性各1例。病例組平均年齡為33.3±9.1歲（年齡分布從20到48歲）；健康對(duì)照組平均年齡為32.7±8.9歲（年齡分布從23到48歲）。
　?、俳】祵?duì)照與病情穩(wěn)定期病例做

16、比較時(shí)，moDC未經(jīng)LPS刺激，ROS表達(dá)水平在兩者間比較的P=0.064；moDC經(jīng)LPS刺激時(shí)，P=0.834。
　?、诮】祵?duì)照與新發(fā)病例做比較時(shí)，moDC未經(jīng)LPS刺激，ROS表達(dá)水平在兩者間比較的P=0.530；moDC經(jīng)LPS刺激時(shí)，P=0.292。
　?、鄄豢紤]疾病活動(dòng)度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體，與健康對(duì)照做比較時(shí)，moDC未經(jīng)LPS刺激，ROS表達(dá)水平在兩者間比較的P=0.791；moDC經(jīng)LPS刺

17、激時(shí)，P=0.496。
　　④考慮LPS刺激前后對(duì)健康對(duì)照或SLE病例自身moDC的影響：健康對(duì)照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/病情穩(wěn)定期病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平，與健康對(duì)照經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/病情穩(wěn)定期病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平做比較，即健康對(duì)照與病情穩(wěn)定期病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較，P=0.447；健康對(duì)照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/新發(fā)病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平，與健康對(duì)照經(jīng)LPS刺

18、激的ROS表達(dá)水平/新發(fā)病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平做比較，即健康對(duì)照與新發(fā)病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較，P=0.293。不考慮疾病活動(dòng)度，將病情穩(wěn)定期病例與新發(fā)病例合為一體：健康對(duì)照未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/SLE病例未經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平，與健康對(duì)照經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平/SLE病例經(jīng)LPS刺激的ROS表達(dá)水平做比較，即所有健康對(duì)照與所有SLE病例經(jīng)刺激前后的比值間的比較，P=0.821。
　　結(jié)論：<

19、br>　　本研究表明：SLE病例與健康對(duì)照外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞，其ROS表達(dá)水平在兩組間無顯著性差異。
　　第二部分 ROS與樹突狀細(xì)胞炎癥性細(xì)胞因子分泌的關(guān)聯(lián)研究
　　目的：
　　比較SLE患者（新發(fā)病例）和正常對(duì)照的樹突狀細(xì)胞內(nèi)pERK表達(dá)水平及分泌的炎癥性細(xì)胞因子差異。分析ROS與pERK及炎癥性細(xì)胞因子間的關(guān)聯(lián)。
　　方法：
　　經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑（rhGM-CSF+rhIL-4）、含S

20、LE血清的培養(yǎng)基兩種方法培養(yǎng)新發(fā)病例與健康對(duì)照的moDC時(shí)（前者為11對(duì)，后者為5對(duì)），收集上清液，-80℃凍存留待檢驗(yàn)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中與Th1，Th2，Th17相關(guān)的炎癥性細(xì)胞因子 IL-2，IL-6，IL-10，IL-17的表達(dá)水平。新發(fā)病例和健康對(duì)照各分為L(zhǎng)PS刺激組和未刺激組。此外，收集經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑（rhGM-CSF+rhIL-4）培養(yǎng)的新發(fā)病例與健康對(duì)照的moDC（11對(duì)，未經(jīng)LPS刺激），裂解細(xì)胞，

21、經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)病例組與對(duì)照組間pERK表達(dá)水平。分析ROS表達(dá)水平與炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)水平、pERK表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)。本研究所采用的病例組、對(duì)照組細(xì)胞來自于第一部分培養(yǎng)的細(xì)胞。數(shù)據(jù)的分析采用SPSS10.01軟件進(jìn)行，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　?。?）兩種方法培養(yǎng)moDC時(shí)，新發(fā)病例與健康對(duì)照的moDC，無論經(jīng)LPS刺激還是未刺激，IL-2、IL-6、IL-10、IL-17的

22、表達(dá)水平在二者間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。（2）經(jīng)完全培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑培養(yǎng)moDC時(shí)，新發(fā)病例組與健康對(duì)照組的moDC未經(jīng)LPS刺激，pERK表達(dá)水平在病例組中明顯低于健康對(duì)照組（P=0.031）。
　?。?）ROS表達(dá)水平與炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)水平、pERK表達(dá)水平間均無顯著性關(guān)聯(lián)（P>0.05）；此外，pERK表達(dá)水平與炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)水平間無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)：與Th1，

23、Th2，Th17相關(guān)的炎癥性細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-17在新發(fā)病例與健康對(duì)照間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但 pERK表達(dá)水平在新發(fā)病例組中明顯低于健康對(duì)照。然而炎癥性細(xì)胞因子（IL-2、IL-6、IL-10、IL-17）的分泌可能與ROS無關(guān)聯(lián)。
　　第三部分 ROS與樹突狀細(xì)胞抗原遞呈能力關(guān)聯(lián)探討，以Th17分化為例
　　目的：
　　將新發(fā)病例與健康對(duì)照的單核細(xì)胞培養(yǎng)成樹突狀細(xì)胞（moDC），然后分別與健康

24、對(duì)照的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，以探討moDC的抗原遞呈能力，以Th17分化為例。分析ROS表達(dá)水平與Th17分化間的關(guān)系，以推測(cè)moDC抗原遞呈能力的改變是否與ROS相關(guān)。
　　方法：
　　新發(fā)病例和健康對(duì)照的單核細(xì)胞經(jīng)含SLE血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天（新發(fā)病例和健康對(duì)照各5例）；獲moDC后，分為不同的濃度組，再與健康對(duì)照（同一人）的T細(xì)胞（濃度恒定）進(jìn)行共培養(yǎng)6天，然后用ELISA法檢測(cè)上清液中與Th17分化相關(guān)的炎癥性細(xì)

25、胞因子TGF-β、IL-6的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞的表達(dá)水平在二者間的差異。分析 ROS表達(dá)水平與炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)水平、Th17細(xì)胞表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)。本研究所采用的病例組、對(duì)照組細(xì)胞來自于第一部分培養(yǎng)的細(xì)胞。數(shù)據(jù)的分析采用SPSS10.01軟件進(jìn)行，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　（1）新發(fā)病例、健康對(duì)照的 moDC，分別與同一健康對(duì)照的 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，TGF-β、IL-6的表達(dá)水平在二者

26、間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　?。?）新發(fā)病例、健康對(duì)照的 moDC，分別與同一健康對(duì)照的 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Th17細(xì)胞的表達(dá)水平在二者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　?。?）ROS表達(dá)水平與炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)水平、Th17細(xì)胞表達(dá)水平間均無顯著性關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　本研究表明：moDC的抗原遞呈能力在病例組與健康對(duì)照組間無顯著性差異（以Th17研究為例），moDC抗原遞呈能