丹酚酸B在脊髓損傷中的作用及其相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:目前，脊髓損傷是醫(yī)學(xué)研究比較重要的領(lǐng)域之一，其發(fā)病率居高不下，由此而引發(fā)的高致殘率以及死亡率逐漸受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家的熱議。急性脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)病理過(guò)程，脊髓的繼發(fā)性損傷可以很明顯的加重原發(fā)性損傷，引起更為嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。脊髓原發(fā)性損傷發(fā)生時(shí)是沒(méi)有任何征兆的，因此如何抑制脊髓繼發(fā)性損傷已經(jīng)成為脊髓損傷領(lǐng)域研究的主要焦點(diǎn)。脊髓繼發(fā)性損傷的病理過(guò)程包括一系列的分子和細(xì)胞反應(yīng)通路，這些分子事件導(dǎo)致了繼發(fā)性損傷的發(fā)

2、生和發(fā)展。自由基的過(guò)量產(chǎn)生是脊髓繼發(fā)性損傷的原因之一。脊髓微循環(huán)障礙的發(fā)生和局部血流減少導(dǎo)致了自由基的過(guò)量產(chǎn)生，并由此引起細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。研究表明細(xì)胞膜對(duì)于維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和正常新陳代謝具有非常重要的作用。在細(xì)胞膜中存在的大量不飽和脂肪酸發(fā)生氧化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，過(guò)量的自由基攻擊與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是造成這種現(xiàn)象的主要原因，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞退化和壞死。急性脊髓損傷發(fā)生時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞和髓鞘亞細(xì)胞的細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生一系列的病理改變，從而影響

3、到細(xì)胞的正常代謝功能。炎癥反應(yīng)是脊髓繼發(fā)性損傷中的主要因素之一，在病理學(xué)中也將其作為核心內(nèi)容來(lái)進(jìn)行研究。炎癥反應(yīng)與基因表達(dá)密切相關(guān)。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員之一，被認(rèn)為是炎癥基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷過(guò)程中，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。通常情況下， NF-κB和IκB以復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞的胞漿中。IKKs是NF-κB激活的主要蛋白激酶，IKKβ亞基是IKKs的主要催化亞基。它會(huì)促使細(xì)

4、胞胞漿內(nèi)的NF-κB和IκB復(fù)合體發(fā)生反應(yīng)，使其具有活性，這種活化作用是通過(guò)IκB的磷酸化來(lái)完成的。當(dāng)NF-κB被激活后，NF-κB的核定位位點(diǎn)就顯露出來(lái)。在這種情況下，胞漿中的NF-κB就能夠很快的進(jìn)入細(xì)胞核，與特異性κB序列發(fā)生作用，這對(duì)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄會(huì)造成很大影響，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生變異，進(jìn)而形成巨量的促炎因子和自由基，從而使細(xì)胞發(fā)生病變。
　　目前SCI臨床抗炎癥反應(yīng)藥物僅有甲強(qiáng)龍。但甲強(qiáng)龍大劑量和較長(zhǎng)時(shí)間使用常引起抵抗力下

5、降、肝功能損害、免疫抑制、骨壞死等副作用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)多種傳統(tǒng)中藥的有效藥物成分被提取出來(lái)，并廣泛應(yīng)用于脊髓損傷的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，取得了良好的效果。丹參是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，目前其兩種水溶性有效成分也已經(jīng)被提取出來(lái)。這兩種成分分別是丹酚酸B和丹參酮ⅡA。其中丹酚酸B已經(jīng)在心臟缺血再灌注、腦缺血再灌注和肝臟纖維化等研究中被證實(shí)有具有抗氧化消除自由基、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。但在脊髓損傷中的作用尚不明確。
　　本次實(shí)驗(yàn)我們擬通

6、過(guò)行為學(xué)觀察，來(lái)分析丹酚酸B對(duì)大鼠急性脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙恢復(fù)的促進(jìn)作用，并研究其在脊髓損傷中對(duì)IKK/NF-κB信號(hào)通路所具有的調(diào)節(jié)作用。分析丹酚酸B對(duì)脊髓損傷后NF-κB表達(dá)、IκB磷酸化、IKKβ激酶活性的影響。并通過(guò)對(duì)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量分析來(lái)研究丹酚酸B在脊髓損傷中的抗氧化作用。此外，還對(duì)丹酚酸B對(duì)抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達(dá)

7、的影響進(jìn)行了分析。希望通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明丹酚酸B在脊髓損傷中具有消除自由基和抗炎作用，以及其在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面所發(fā)揮出的積極作用，為將來(lái)實(shí)現(xiàn)丹酚酸B的臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、取生長(zhǎng)期為7周的健康雌性SD大鼠，體重范圍220g-250g。利用改良Allen法制備SD大鼠急性脊髓損傷模型，以胸12椎體為目標(biāo)打擊位置，打擊能量設(shè)置為25g*cm。
　　2、實(shí)驗(yàn)中大鼠隨機(jī)分為如下三組:假手術(shù)組（僅切除椎

8、板，不損傷脊髓）、丹酚酸B治療組（術(shù)后半小時(shí)腹腔注射丹酚酸B10mg/kg）、脊髓損傷組（腹腔注射等量PBS液）。
　　3、觀察丹酚酸B對(duì)急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的促進(jìn)作用:實(shí)驗(yàn)期間術(shù)后第1日及每周進(jìn)行一次BBB評(píng)分、斜坡實(shí)驗(yàn)和印跡實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4周;術(shù)后4周進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)。
　　4、觀測(cè)丹酚酸B消除自由基以及減輕過(guò)氧化反應(yīng)作用:在脊髓損傷后24小時(shí)處死動(dòng)物，擬行脊髓損傷區(qū)勻漿檢測(cè)的取1cm脊髓組織，擬行血漿檢測(cè)的心臟取血

9、。對(duì)血漿和損傷區(qū)組織中的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛和一氧化氮的含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　5、觀測(cè)丹酚酸B對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響:在脊髓損傷后24小時(shí)將動(dòng)物處死，然后取其長(zhǎng)度為1 cm的脊髓樣本，運(yùn)用免疫印跡分析和免疫組織化學(xué)來(lái)對(duì)脊髓損傷后的抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax進(jìn)行分析和檢測(cè)，分別得到兩種凋亡基因的表達(dá)。
　　6、觀測(cè)丹酚酸B對(duì)IKKβ亞基激酶活性的影響:在脊髓損傷后12小時(shí)，將動(dòng)物處死并將1cm的脊

10、髓組織取出，通過(guò)IKKβ亞基激酶光譜法來(lái)對(duì)丹酚酸B對(duì)IKKβ亞基激酶所造成的影響進(jìn)行測(cè)定。
　　7、觀測(cè)丹酚酸B對(duì)NF-κB p65和磷酸化I-κBα的表達(dá)所產(chǎn)生的影響，觀察MPO活力的變化情況:脊髓損傷后24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)將大鼠處死，以損傷區(qū)為中心取長(zhǎng)度為1cm的脊髓樣本，通過(guò)免疫組織化學(xué)和western blot法來(lái)分析和檢測(cè)損傷后脊髓組織中磷酸化I-κBα和NF-κB p65的表達(dá)，應(yīng)用MPO活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脊髓標(biāo)本中MPO活

11、性。
　　8、觀察丹酚酸B對(duì)脊髓空洞率的影響:實(shí)驗(yàn)4周后，處死動(dòng)物取1cm脊髓組織應(yīng)用HE染色分析各組脊髓空洞率。
　　結(jié)果:
　　1、經(jīng)過(guò)連續(xù)4周的實(shí)驗(yàn)，BBB評(píng)分、斜坡實(shí)驗(yàn)、印跡實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):除術(shù)后第1日，在其他各時(shí)間點(diǎn)丹酚酸B組大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙相對(duì)于脊髓損傷組有很明顯的減輕(P＜0.05)。但在游泳實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)丹酚酸B對(duì)于大鼠尾部運(yùn)動(dòng)功能的提升是非常有限的(P＞0.05)。
　　2、術(shù)后2

12、4小時(shí)，脊髓損傷組大鼠血漿及損傷區(qū)組織中SOD和GSH-PX活性明顯降低;相對(duì)于脊髓損傷組，丹酚酸B可以明顯提高大鼠脊髓損傷后血漿和損傷區(qū)脊髓組織中的SOD和GSH-PX活力(P＜0.05)，從而通過(guò)提高抗氧化作用減輕繼發(fā)性損傷。在大鼠脊髓損傷后24小時(shí)，對(duì)損傷區(qū)脊髓組織和血漿進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn):相對(duì)于假手術(shù)組，損傷區(qū)脊髓組織和血漿中的NO和MDA的含量顯著提升(P＜0.01)，丹酚酸B在大鼠脊髓損傷后能夠有效降低NO和MDA的含量(P＜0.

13、05)，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，能夠?qū)ρX屏障形成保護(hù)，有效降低組織水腫，進(jìn)而形成對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)。
　　3、在脊髓損傷后12小時(shí)，脊髓損傷組中IKKβ激酶活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，丹酚酸B可以明顯降低傷后12小時(shí)IKKβ激酶活性(P＜0.05)。脊髓損傷后24小時(shí)，相較于假手術(shù)組，損傷組中MPO活性明顯升高(P＜0.01)，丹酚酸B可以明顯抑制它的升高(P＜0.05)。在術(shù)后24小時(shí)，免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí):假手術(shù)組中幾乎沒(méi)有磷酸

14、化I-κBα和NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，脊髓損傷組中大鼠磷酸化I-κBα和NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01)，丹酚酸B可以明顯減少脊髓組織中磷酸化I-κBα和NF-κB p65的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(P＜0.05)。蛋白質(zhì)免疫印跡方法結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)檢測(cè)的結(jié)論。同時(shí)經(jīng)過(guò)連續(xù)4周實(shí)驗(yàn)，丹酚酸B治療組大鼠脊髓空洞率較脊髓損傷組有了明顯的降低(P＜0.05)。
　　4、在脊髓損傷后24小時(shí)，Western b

15、lot和免疫組化兩種方法都顯示:相較于假手術(shù)組，Bax表達(dá)在脊髓損傷后有明顯的增加(P＜0.01)，而丹酚酸B能夠明顯使Bax表達(dá)減少(P＜0.05);術(shù)后24小時(shí)，假手術(shù)組幾乎沒(méi)有Bcl-2表達(dá)，丹酚酸B治療組和脊髓損傷組中Bcl-2表達(dá)量明顯增加(P＜0.01)，丹酚酸B治療對(duì)Bcl-2表達(dá)沒(méi)有影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)過(guò)BBB評(píng)分、斜坡實(shí)驗(yàn)、印跡實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹酚酸B對(duì)急性脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功