丹酚酸B的提取分離及其對血管舒張作用的研究.pdf

1、丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）是我國應(yīng)用較早的中藥材，其藥效廣泛?！吨袊幍洹?2005)中記載丹參有“活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩”等功效，為許多方劑和現(xiàn)代中藥的主要原料，臨床上應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代藥學(xué)及藥理學(xué)研究表明，丹參中的水溶性多酚酸類物質(zhì)是其主要活性部位，其藥用功效不斷被證明。丹酚酸B是丹參中含量最高的水溶性成分，因其獨特的藥理活性，成為近年來的研究熱點。但丹酚酸B穩(wěn)定性較差，給高純度丹酚酸B的獲得增加了難

2、度，也給丹酚酸B的臨床應(yīng)用帶來了隱患。
　　本文以丹參為原料，采用HPLC和TCL分析檢測方法，以丹酚酸B的含量、得率為檢測指標，在研究丹酚酸B穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，對從丹參中獲得高純度丹酚酸B的工藝條件進行了初步探索與優(yōu)化；在分離獲得高純度丹酚酸B的基礎(chǔ)上，采用離體動脈灌流方法，以大鼠離體胸主動脈血管環(huán)為模型，血管環(huán)張力大小為實驗指標，研究丹酚酸B對大鼠胸主動脈的作用及其機制，為丹酚酸B藥物的開發(fā)及在心腦血管疾病治療方面提供了理論依據(jù)

3、。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　（1）通過對丹酚酸B的分析檢測方法的研究，確定了丹酚酸B的HPLC及TCL的測定方法。HPLC檢測方法為：色譜柱，XB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相，甲醇：0.02％磷酸（50:50）；檢測波長，284 nm；柱溫，30℃；流速，0.7 mL/min，經(jīng)過方法學(xué)考察，驗證此方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，并測定了丹酚酸 B標準曲線，得回歸方程Y=29479X＋790.01，R2

4、=0.9995，表明丹酚酸B在0.042 mg/mL～0.840 mg/mL范圍內(nèi)與所得峰面積線性關(guān)系良好；TCL檢測方法為，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4:5:1:1），能夠?qū)崿F(xiàn)丹酚酸B和其它物質(zhì)分離。
　?。?）以自制丹酚酸B為原料，通過單因素實驗法，對丹酚酸B水溶液的穩(wěn)定性進了研究，分別考察了時間、溫度、pH值、丹酚酸B濃度對水溶液穩(wěn)定的影響，得出丹酚酸B在60℃，加熱時間＞10 h時，丹酚酸B含量迅速降低；丹酚酸B水溶液

5、在0℃～60℃內(nèi)丹酚酸B含量相對穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過60℃時，含量顯著下降；丹酚酸B水溶液在pH=2左右時最為穩(wěn)定，當(dāng)pH＞4時，穩(wěn)定性逐漸變差，pH達到10后，丹酚酸B幾乎完全降解；丹酚酸B水溶液在高濃度時穩(wěn)定性高于較低濃度。
　?。?）在以上研究基礎(chǔ)上，對從丹參藥材中獲得高純度丹酚酸B的工藝進行了研究。首先以丹酚酸B得率為檢測指標，選定提取方法為以未粉丹參藥材原料，8 BV pH=2酸水（浸泡12 h）滲漉提取，流速為4 mL/m

6、in；然后用靜態(tài)實驗與動態(tài)實驗相結(jié)合的方法，以丹酚酸B的含量、吸附量和解吸量為指標，對DM130、AB-8、D101、XAD-8及LX-68G五種大孔樹脂進行選擇，最終選定AB-8為丹酚酸B分離樹脂，吸附量可達41.36 mg/g，且最先到達吸附平衡，解吸率為98.38%，并進一步對丹酚酸B AB-8分離工藝進行研究，確定上樣后，先用3 BV pH=2酸水洗脫雜質(zhì)，再用6 BV20%乙醇、5 BV40%乙醇進行梯度洗脫，既得純度為83.

7、5%的丹酚酸B；為保證丹酚酸B固體良好的性狀，進行乙酸乙酯萃取，條件為40%乙醇洗脫液濃縮至丹酚酸B含量約15 mg/mL，加等體積的乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，冷凍干燥，既得丹酚酸B粗品；最后以丹酚酸B含量為檢測指標，對丹酚酸B進行硅膠柱純化，條件為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4:5:1:1）為洗脫溶劑，上樣量與柱體積之比（mg/ml）為（2.0～2.5）：5，洗脫流速為1 mL/min（每500 mL柱體積），經(jīng)硅膠柱純化，得含量

8、＞98%的丹酚酸B，回收率為51.52%。
　?。?）以大鼠離體胸主動脈血管環(huán)為模型，血管環(huán)張力大小為指標，從丹酚酸B對血管環(huán)基礎(chǔ)張力、NA，KCl，L-NAME，MB，IM預(yù)處理血管環(huán)及細胞內(nèi)鈣外流、外鈣內(nèi)流幾方面的影響，研究丹酚酸 B對血管環(huán)的作用及機制，結(jié)果表明，丹酚酸B具有擴張血管的作用，且部分依賴于內(nèi)皮細胞，主要作用于內(nèi)皮依賴性的NO-cGMP信號通路，細胞內(nèi)鈣離子的釋放，并通過抑制ROC來抑制細胞外鈣離子內(nèi)流，通過多信