雙丹口服液中主要有效成分丹酚酸B配伍丹皮酚治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用及其機(jī)制.pdf

1、1、研究目的
　　雙丹口服液系收載于《中國藥典》（2005、2010年版）一部的中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑，由丹參、牡丹皮組成，功能為活血化瘀、通絡(luò)止痛，用于瘀血痹阻所致的胸痹，癥見胸悶、心痛。雙丹口服液是臨床常用制劑，治療胸痹的有效率達(dá)到90％以上，并且能顯著改善中醫(yī)癥候。但雙丹口服液成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明，難以得到國際認(rèn)同；因此，對雙丹口服液進(jìn)行分子中藥二次開發(fā)，闡明其治療胸痹的機(jī)制，有著重要的意義。本課題采用其主要有效成分丹酚酸B（Sal

2、vianolicacidB，SalB）與丹皮酚（Paeonol，Pae），按照雙丹口服液中的含量和配比進(jìn)行配伍組方，組成分子中藥，發(fā)揮二者協(xié)同作用。采用建立體內(nèi)動(dòng)物模型，體外冠狀動(dòng)脈組織培養(yǎng)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型等方法，探討和揭示分子中藥SalB配伍Pae抗動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張冠脈血流、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為源于雙丹口服液的分子中藥新藥二次開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2、方法
　　2.1建立同時(shí)測定雙丹口服液中主要有效成分

3、SalB及Pae含量的方法：采用HPLC法測定雙丹口服液中SalB和Pae的含量，色譜條件為色譜柱SinoChromODS-BPC18（4.6mm×250mm，5μm，Yilite），柱溫30°C，檢測波長280nm，流速1mL·min-1，C18保護(hù)柱，流動(dòng)相采用甲醇及2％的冰醋酸梯度洗脫，洗脫條件如下：甲醇-2％冰醋酸（12∶88）12min，甲醇-2％冰醋酸（50∶50）1min內(nèi)調(diào)整到甲醇-2％冰醋酸（70∶30）至到30min

4、，進(jìn)樣量10μL。并對此測定方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，包括線性關(guān)系考察、精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、加樣回收率實(shí)驗(yàn)。
　　2.2SalB配伍Pae對高脂誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈硬化的實(shí)驗(yàn)研究：高脂飲食配合灌胃丙基硫氧嘧啶建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，分組給藥4周后，測定大鼠的心率、血壓、呼吸；血脂指標(biāo)：血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白A（APOA）、載脂蛋白

5、B（APOB）；血清中氧化酶：一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量；并對主動(dòng)脈血管進(jìn)行了病理形態(tài)學(xué)的觀察。
　　2.3SalB配伍Pae對離體大鼠冠狀動(dòng)脈收縮的影響：采用高K+溶液使冠脈去極化，使PDC通道開放，外鈣內(nèi)流，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣釋放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，引起冠脈平滑肌收縮，分別加入不同濃度的KCl、CaCl2溶液，觀察給予SalB配伍Pae后對其收縮的影響；His

6、t可與冠脈平滑肌細(xì)胞膜上的組胺受體結(jié)合，啟動(dòng)ROC通道，引起鈣離子內(nèi)流，誘發(fā)血管收縮，加入不同濃度的Hist溶液后考察SalB配伍Pae對此種收縮的抑制作用；在無鈣克氏液中加入Hist，考察SalB配伍Pae對內(nèi)鈣釋放所引起收縮的抑制作用，而后再加入Ca2+，考察其對外鈣內(nèi)流所引起收縮的阻滯作用。
　　2.4SalB配伍Pae對H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用及其機(jī)制：采用H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型

7、，應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察方法，MTT檢測細(xì)胞活性、Hoechst33342染色和電鏡等方法考察SalB配伍Pae對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，利用SYBRGreenRT-PCR方法檢測藥物作用內(nèi)皮細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA的表達(dá)變化；Westernblot法檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)。
　　3、結(jié)果
　　3.1雙丹口服液中SalB及Pae的含量：雙丹口服液中Sa

8、lB及Pae的含量分別約為12mg·mL-1及0.20mg·mL-1，所建立的含量檢測方法簡便可靠，峰型良好，穩(wěn)定性，重現(xiàn)性，回收率均符合要求。
　　3.2SalB配伍Pae對高脂誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈硬化的影響：SalB配伍Pae對動(dòng)脈粥樣硬化大鼠心率、血壓、呼吸均無明顯影響（P>0.05）；但能明顯降低血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、丙二醛及NOS含量（P<0.05或P<0.01）、并能明顯升高血清中高密度脂蛋白、超氧化物歧化

9、酶和一氧化氮水平（P<0.05或P<0.01）；對血清中的載脂蛋白A、載脂蛋白也B有明顯的調(diào)節(jié)作用（P<0.05或P<0.01）。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)給藥組對動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊，內(nèi)膜增厚程度及結(jié)締組織成分具有明顯改善。
　　3.3SalB配伍Pae對離體大鼠冠狀動(dòng)脈收縮的影響：在克氏液中加入KCl的不同累積濃度，在無鈣高鉀的克氏液中加入CaCl2的不同累積濃度，在克氏液中加入Hist的不同累積濃度后，大鼠冠脈環(huán)均會(huì)出現(xiàn)量效依賴性收縮，在藥

10、物（SalB配伍Pae）孵育后，給予同等程度的KCl、CaCl2、Hist刺激，量-效曲線均朝右下方移動(dòng)，達(dá)到峰值時(shí)間延長且最大反應(yīng)降低；在無鈣克氏液中，Hist使標(biāo)本收縮，達(dá)到峰值，CaCl2使冠脈環(huán)進(jìn)一步收縮，給予藥物SalB配伍Pae后，對二相收縮均有明顯的抑制作用；結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。
　　3.4SalB配伍Pae對H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用及其機(jī)制：SalB配伍Pae

11、含藥血清組對H2O2損傷的細(xì)胞狀態(tài)有所改善，并且呈劑量依賴；內(nèi)皮細(xì)胞的活性效應(yīng)隨著培養(yǎng)液中SalB配伍Pae含藥血清的濃度的增加而增強(qiáng)，2％含藥血清組與模型組相比，數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而4％、6％含藥血清組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；含藥血清濃度為2％時(shí)產(chǎn)生增殖效應(yīng)，增殖率為50.25％；濃度為4％時(shí)，增殖率為67.37％；濃度為6％時(shí)，增殖率為67.14％，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Hoechst333

12、42染色、透射電鏡結(jié)果表明SalB配伍Pae含藥血清組隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡的情況逐漸改善，其中中、高劑量組大部分細(xì)胞存活狀態(tài)良好；細(xì)胞中Bcl-2基因mRNA水平上升，而Bax基因、caspase-3的表達(dá)降低，與Westernblot方法檢測蛋白含量的結(jié)果較為一致，且數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4、結(jié)論
　　采用HPLC方法測定雙丹口服液中SalB及Pae的含量及配比，并以此作為分子中藥（SalB配伍

13、Pae）的組方依據(jù)，采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、體外組織血管模型、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型，證實(shí)了SalB配伍Pae的抗動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張冠脈血管、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。其機(jī)制可能與降低血清TC、TG、LDL、MDA、NOS含量，升高HDL、SOD、NO水平，抗氧化和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝延緩或減輕AS形成有關(guān)；通過抑制血管平滑肌細(xì)胞外鈣內(nèi)流（抑制PDC及ROC通道）和抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放來擴(kuò)張冠脈血管；通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax基因及蛋白的表達(dá)，抑制