缺氧誘導絲裂原因子作為細胞外鈣敏感受體的非經(jīng)典配體在慢性缺氧性肺動脈高壓中的作用和機制.pdf

1、目的：研究缺氧誘導絲裂原因子(hypoxia induced mitogenic factor,HIMF)作為細胞外鈣敏感受體的(extracellular calcium-sensing receptor,CaSR)的非經(jīng)典配體在慢性缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的增殖和肺動脈高壓中的作用和機制。
　　方法：(1)通過免疫沉淀技術篩選出在慢性缺

2、氧性肺動脈高壓中和HIMF相互作用的G蛋白偶聯(lián)受體；(2)原代培養(yǎng)PASMCs；(3)免疫共沉淀技術和免疫熒光技術檢測HIMF和CaSR的相互作用和共定位情況；(4)酵母雙雜交技術篩選出和HIMF主要作用的CaSR氨基酸位點；(5)用不同的細胞外鈣離子濃度([Ca2+]o)處理PASMCs后用鈣離子熒光探針Fura-2/AM和鈣離子熒光成像系統(tǒng)檢測胞漿內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)；(6)PASMCs轉染CaSR shRNA和CaSR突

3、變質(zhì)粒(突變CaSR和HIMF特異性結合的四個氨基酸位點的質(zhì)粒)下調(diào)和突變CaSR的表達，PASMCs轉染HIMF shRNA和HIMF過表達質(zhì)粒下調(diào)和上調(diào)HIMF的表達；(7)合成特異性的穿膜肽競爭HIMF和CaSR的結合位點，阻止HIMF和CaSR的結合；(8)用CCK8試劑盒檢測PASMCs增殖的情況；(9)Calhex231和特異性穿膜肽注射SD大鼠和慢病毒感染SD大鼠；(10)western和ELLISA檢測慢病毒效應；(11

4、)power lab檢測肺動脈壓、體循環(huán)壓和心輸出量；(12)western檢測HIMF和CaSR的結合是否影響CaSR二聚體的形成；(13)通過鈣成像技術檢測抑制HIMF和CaSR相互作用的特異性多肽在正常的條件下是否對CaSR的正常功能有影響。
　　結果：(1)免疫共沉淀技術篩選出在缺氧性肺動脈高壓中HIMF是通過CaSR這個G蛋白偶聯(lián)受體起的作用；(2)免疫共沉淀技術和免疫熒光技術檢測HIMF和CaSR在原代培養(yǎng)的PASMC

5、s和缺氧后SD大鼠的肺動脈中（PA）可以相互結合且存在共定位；(3)酵母雙雜交技術篩選出和HIMF主要作用的CaSR氨基酸位點是位于CaSR胞內(nèi)段885-888aa這4個氨基酸；(4)慢性缺氧可以導致CaSR敏感性增加和PASMCs的增殖，這個效應能被CaSR的特異性抑制劑Calhex231、CaSR shRNA、CaSR mutation、特異性穿膜肽和HIMF shRNA抑制；(5)常氧情況下過表達HIMF可以導致CaSR敏感性增加

6、和PASMCs的增殖，這個效應能被CaSR的特異性抑制劑Calhex231和CaSR shRNA抑制；(6)將包裝CaSR和HIMF干擾的特異性質(zhì)粒、CaSR突變質(zhì)粒和HIMF過表達質(zhì)粒的慢病毒氣道注入SD大鼠72小時候后開始造動物模型，活體實驗中，慢性缺氧可以引起SD大鼠肺動脈壓力、肺循環(huán)阻力、右心肥厚指數(shù)和肺動脈中層平滑肌厚度的增加，這個效應能被CaSR的特異性抑制劑Calhex231、CaSR shRNA、CaSR突變、HIMF

7、shRNA和特異性穿膜肽抑制；(7)常氧情況下過表達HIMF可以導致SD大鼠肺動脈壓力、肺循環(huán)阻力、右心肥厚指數(shù)和肺動脈中層平滑肌厚度的增加，這個效應也能被CaSR的特異性抑制劑Calhex231和CaSR shRNA抑制；(8)ELISA檢測HIMF shRNA慢病毒干擾了HIMF的表達和HIMF過表達慢病毒使常氧時HIMF基因的表達增加，western檢測轉染CaSR shRNA時CaSR表達減少和轉染CaSR突變質(zhì)粒時CaSR表達

8、增加；(9)HIMF和CaSR的結合通過影響CaSR的二聚體的形成而使得CaSR敏感性增高；(10)在正常的條件下，特異性穿膜肽只是阻礙CaSR和HIMF相互作用，并不影響CaSR其本身的生理功能。
　　結論：慢性缺氧誘導HIMF表達的增加后使得HIMF和CaSR結合增加，這促進了CaSR二聚體形成的增加，進而增強PASMCs上CaSR的敏感性，使其更容易被[Ca2+]o激活，[Ca2+]o內(nèi)流導致[Ca2+]i的增加和PASMC