轉(zhuǎn)錄因子KLF5在缺氧性肺動(dòng)脈高壓中的作用.pdf

1、第一部分轉(zhuǎn)錄因子KLF5在缺氧性肺動(dòng)脈高壓中的作用
　　目的：缺氧性肺動(dòng)脈高壓是一種復(fù)雜的系統(tǒng)性疾病，肺小動(dòng)脈重構(gòu)是其主要的病理特征。KLF5（Krüppel-like factor5）作為一種鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及遷移過程。它在肺動(dòng)脈高壓病人的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)KLF5參與了心血管重構(gòu)的形成過程。然而，目前KLF5在缺氧性肺動(dòng)脈高壓中的作用及分子機(jī)制尚不清楚。
　　方法：實(shí)

2、驗(yàn)采用成年雄性SD大鼠（體重為200-250g），分別置于常氧或缺氧環(huán)境（10％氧濃度）中培養(yǎng)。檢測大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，評(píng)估其肺動(dòng)脈中膜厚度和右心室肥厚程度，行肺組織HE染色觀測大鼠血管重構(gòu)情況。在常氧或缺氧（5%氧濃度）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（humanpulmonary artery smooth muscle cells，HPASMC）。在HPASMC中行CCK-8、BrdU標(biāo)記、PI單染、Annexin-V/PI雙染、t

3、ranswell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞遷移能力。行免疫印跡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測目的蛋白水平。行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測目的基因mRNA水平。提取暴露于常氧和缺氧環(huán)境的 HPASMC裂解產(chǎn)物，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)明確 KLF5和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）之間是否存

4、在關(guān)聯(lián)。采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)HPASMC中KLF5和HIF-1α的表達(dá)。為上調(diào)KLF5水平，建立過表達(dá)KLF5基因的慢病毒載體并感染HPASMC。構(gòu)建KLF5基因短發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，通過尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)以下調(diào)KLF5表達(dá)。
　　結(jié)果：缺氧組大鼠的平均肺動(dòng)脈壓力顯著升高，伴隨遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈中膜增厚及右心室肥厚。缺氧引

5、起大鼠肺動(dòng)脈中膜層PCNA、Ki67陽性細(xì)胞增多，TUNEL陽性細(xì)胞減少。缺氧HPASMC的增殖和遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少。沉默KLF5或HIF-1α可以逆轉(zhuǎn)這些生物學(xué)改變。在平滑肌細(xì)胞中，沉默 KLF5后 HIF-1α蛋白水平下調(diào)，過表達(dá)KLF5可以上調(diào)HIF-1α水平，而沉默HIF-1α后KLF5表達(dá)無顯著改變。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示 KLF5和HIF-1α存在直接結(jié)合，缺氧刺激下沉淀的目的蛋白增多。細(xì)胞周期蛋白cyclin B1、c

6、yclin D1和凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、survivin、caspase-3和caspase-9參與了KLF5-HIF-1α軸對(duì)HPASMC生長的調(diào)控。KLF5沉默大鼠的肺動(dòng)脈中 HIF-1α表達(dá)顯著下調(diào)，平均肺動(dòng)脈壓和肺動(dòng)脈重構(gòu)情況顯著改善，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：缺氧促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移增加，凋亡減少，血管重構(gòu)形成。本研究從細(xì)胞水平和在體水平驗(yàn)證了 KLF5-HIF-1α軸存在于缺氧大鼠的肺動(dòng)脈平

7、滑肌細(xì)胞，并且在缺氧性肺血管重構(gòu)中發(fā)揮了重要作用。KLF5是缺氧性肺動(dòng)脈高壓治療的潛在靶點(diǎn)。
　　第二部分轉(zhuǎn)錄因子KLF5在在缺氧對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用
　　目的：轉(zhuǎn)錄因子KLF5在腫瘤組織中廣泛表達(dá)，且是腫瘤的一個(gè)預(yù)后因子。然后，KLF5在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚未闡明。缺氧通過HIF-1α在腫瘤的發(fā)展中起重要作用。本研究旨在探討 KLF5在缺氧性肺癌細(xì)胞生長中的作用以及 KLF5和HIF-1α的潛在關(guān)聯(lián)。

8、r>　　方法：我們通過對(duì)暴露于常氧（20%氧濃度）或缺氧（1%氧濃度）環(huán)境的 A549細(xì)胞進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、CFSE標(biāo)記實(shí)驗(yàn)、Annexin-V/PI實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的活力、克隆形成能力、增殖和凋亡。通過合成小干擾 RNA來下調(diào) KLF5和HIF-1α的表達(dá)。采用PCR和免疫印跡的方法檢測mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：研究顯示缺氧可以增強(qiáng) A549細(xì)胞活力、克隆形成能力，促進(jìn)增殖，抑制細(xì)胞凋亡。缺氧上調(diào)HIF-

9、1α和KLF5的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性。沉默KLF5和HIF-1α可以通過下調(diào)cyclin B1、survivin，上調(diào)caspase-3逆轉(zhuǎn)缺氧引起的細(xì)胞活力增加和凋亡減少。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示KLF5和HIF-1α存在直接關(guān)聯(lián)，且缺氧環(huán)境中沉淀的目的蛋白更多。此外，沉默KLF5可以降低HIF-1α的水平，而KLF5表達(dá)不受HIF-1α的影響，確定了KLF5是HIF-1α的上游調(diào)控因子。
　　結(jié)論：本研究證實(shí)缺氧是一個(gè)促癌因素，在肺癌