轉(zhuǎn)錄因子KLF5在腹主動(dòng)脈瘤形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysms，AAA）是一種慢性炎癥性疾病，其病理特征是主動(dòng)脈壁的重塑，常常由于主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤破裂而導(dǎo)致病人死亡。AAA的形成是與多種因素有關(guān)，包括巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，炎性因子和蛋白酶的釋放，彈力纖維的斷裂，血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，膠原蛋白降解等，其中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在AAA的發(fā)病機(jī)理中具有重要作用。研究已經(jīng)報(bào)道，慢性炎癥狀態(tài)（包括動(dòng)脈粥樣硬化、氧化應(yīng)激、血管緊張素II和炎性細(xì)胞因子）激活單核

2、/巨噬細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞滲透到血管壁并釋放蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白和彈性蛋白；同時(shí)，浸潤(rùn)進(jìn)血管壁的巨噬細(xì)胞在血管中膜和外膜分泌炎性細(xì)胞因子，如：TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。
　　巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)至血管壁的過(guò)程需要肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重新組構(gòu)。在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中產(chǎn)生一種膜突出結(jié)構(gòu)：偽足小體（podosome）。目前已知，多種細(xì)胞結(jié)蛋白和信號(hào)蛋白以肌絲蛋白為核心包裹行成的束狀pod

3、osome參與細(xì)胞的局部黏附和遷移。束狀 podosome呈現(xiàn)為點(diǎn)狀的染色，壽命2-10 min左右，但在炎癥環(huán)境下，束狀podosome逐漸積聚變?yōu)榄h(huán)形podosome（稱為podosome rosette），這種結(jié)構(gòu)可持續(xù)數(shù)小時(shí)，持續(xù)進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）消化并促使細(xì)胞遷移。此外，podosome還包含多個(gè)信號(hào)蛋白，其中RhoA是podosome形成的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子。但是，目前關(guān)于pod

4、osome形成及其與巨噬細(xì)胞遷移的關(guān)系仍不清楚。
　　Myo9b作為一種與肌絲蛋白相關(guān)的馬達(dá)蛋白，其分子中包含的RhoGAP蛋白結(jié)構(gòu)域具有抑制Rho信號(hào)的作用，因而能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極性和遷移。盡管Myo9b在破骨細(xì)胞中表達(dá)并調(diào)節(jié)podosome形成已有報(bào)道，但是Myo9b與動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系尚未闡明。
　　人類Krüppel樣因子5（KLF5）屬于SP/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族，其在羧基末端具有三個(gè)共同的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)

5、。大量研究表明KLF5可以激活多種與心血管重塑相關(guān)的基因。已有報(bào)道，KLF5在大型未破裂的腦動(dòng)脈瘤中高度表達(dá)，但是KLF5介導(dǎo)AAA形成的確切機(jī)制尚不清楚。在AAA形成過(guò)程中，KLF5與 podosome形成和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系仍然未知。因此，本研究利用CaPO4誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤模型和人AAA組織，探討Myo9b在KLF5介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞podosome形成和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用，旨在為闡明KLF5在動(dòng)脈瘤中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。<

6、br>　　第一部分 KLF5通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移參與腹主動(dòng)脈瘤的形成
　　目的：探討KLF5對(duì)巨噬細(xì)胞遷移的影響及其在AAA形成中的作用。
　　方法：1通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和免疫組化檢測(cè)人AAA組織中KLF5的表達(dá)，免疫雙熒光共定位檢測(cè)KLF5在血管組織中巨噬細(xì)胞和VSMCs的表達(dá)。2構(gòu)建CaPO4誘導(dǎo)的小鼠AAA模型，HE染色證實(shí)模型成功。qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)小鼠AAA組織中KLF5的表達(dá)。免疫雙

7、熒光共定位檢測(cè)KLF5在小鼠AAA組織巨噬細(xì)胞和VSMCs中的表達(dá)。3雜交培育骨髓源單核細(xì)胞KLF5基因特異性敲除小鼠并建立AAA模型。4 HE和EVG染色檢查血管組織和彈力纖維的變化。5免疫雙熒光共定位KLF5和巨噬細(xì)胞。
　　結(jié)果：
　　1人AAA組織中KLF5表達(dá)升高
　　與人正常主動(dòng)脈組織相比，人AAA組織中KLF5mRNA表達(dá)水平升高，免疫組化KLF5染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加。對(duì)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒

8、光染色的結(jié)果顯示，在人AAA組織中巨噬細(xì)胞明顯增多，并且平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中KLF5表達(dá)均明顯增多，說(shuō)明KLF5表達(dá)水平升高可能在AAA形成中發(fā)揮作用。
　　2 CaPO4誘導(dǎo)的小鼠AAA中KLF5表達(dá)水平增加
　　在形態(tài)學(xué)檢查證實(shí)，用CaPO4誘導(dǎo)成功建立小鼠AAA模型的基礎(chǔ)上，檢查KLF5在實(shí)驗(yàn)型AAA組織中的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，KLF5 mRNA表達(dá)水平隨著CaPO4誘導(dǎo)天數(shù)的增加而升高，在第7天和第1

9、4天分別升高了2.39倍和2.14倍。免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)，KLF5在巨噬細(xì)胞和VSMCs中均有表達(dá)，這與在人AAA組織中的檢測(cè)結(jié)果相同。這些結(jié)果表明，KLF5參與人和小鼠AAA的形成。
　　3巨噬細(xì)胞特異性敲除KLF5能減緩CaPO4誘導(dǎo)的小鼠AAA形成
　　KLF5-flox小鼠和 LysM-cre小鼠雜交培育遺傳性敲除巨噬細(xì)胞中KLF5的小鼠（KLF5-/-），與野生型（WT）小鼠相比，KLF5-/-小鼠經(jīng)CaPO4誘

10、導(dǎo)的腹主動(dòng)脈膨脹率顯著降低。HE染色結(jié)果顯示，KLF5-/-小鼠的腹主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)接近正常，彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。結(jié)果顯示KLF5-/-小鼠腹主動(dòng)脈的彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與WT組比較，在KLF5-/-小鼠的血管組織中，KLF5染色陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果表明，KLF5通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)而參與AAA形成。
　　小結(jié)：
　　KLF5在人和CaPO4誘導(dǎo)的小鼠AAA組織中

11、表達(dá)升高。KLF5在血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均進(jìn)行表達(dá)。巨噬細(xì)胞特異性敲除KLF5能夠減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制CaPO4誘導(dǎo)的小鼠AAA的形成。
　　第二部分 KLF5通過(guò)上調(diào)Myo9b表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞podosome的形成和遷移
　　目的：揭示 KLF5促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)的分子與細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：1體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察 WT和 KLF5-/-巨噬細(xì)胞的遷移。2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察WT和KL

12、F5-/-巨噬細(xì)胞的侵襲能力。3掃描電鏡觀察巨噬細(xì)胞跨膜遷移時(shí)細(xì)胞足突。4活細(xì)胞工作站觀察 WT和 KLF5-/-巨噬細(xì)胞的徑向運(yùn)動(dòng)變化。5 mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)WT和KLF5-/-巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)差異。6 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)。7在巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和敲低KLF5后檢查運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)變化。8報(bào)告基因檢測(cè)KLF5對(duì)Myo9b基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。9 Oligo pull-down分析確定KLF5在Myo9b基因

13、啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1 KLF5-/-巨噬細(xì)胞的遷移功能受損
　　從KLF5-/-和WT小鼠分離培養(yǎng)骨髓源巨噬細(xì)胞，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， KLF5-/-巨噬細(xì)胞的遷移進(jìn)入劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量比 WT巨噬細(xì)胞顯著減少。Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與WT巨噬細(xì)胞相比，KLF5-/-巨噬細(xì)胞的侵襲能力受損。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，與WT巨噬細(xì)胞相比，KLF5-/-巨噬細(xì)胞具有更少、更短的突觸和偽足。細(xì)胞免疫雙

14、熒光染色結(jié)果顯示，跨越濾膜的KLF5-/-巨噬細(xì)胞幾乎不表達(dá)KLF5。進(jìn)一步用動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，與WT巨噬細(xì)胞相比，KLF5-/-巨噬細(xì)胞的徑向遷移能力受損，遷移速率明顯降低。
　　2 KLF5通過(guò)直接與Myo9b啟動(dòng)子結(jié)合而上調(diào)Myo9b表達(dá)
　　mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，與 WT組比較，KLF5-/-小鼠的運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因在CaPO4損傷的主動(dòng)脈組織中表達(dá)顯著下降。Gene Ontology富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表

15、達(dá)的基因主要集中于細(xì)胞 Myosin肌絲和 Myosin復(fù)合物等蛋白相關(guān)基因。qRT-PCR對(duì)芯片分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，Myo9a、Myo9b和Macf1基因表達(dá)在KLF5-/-小鼠顯著下調(diào)。分別在Raw264.7中過(guò)表達(dá)或敲低 KLF5，PCR和 Western blotting結(jié)果均顯示，在基礎(chǔ)水平和TNF-α誘導(dǎo)情況下，在巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲低KLF5均能夠顯著增加或降低Myo9a和Myo9b的mRNA和蛋白水平。報(bào)告基因和Oligo

16、 pull-down分析結(jié)果表明，KLF5通過(guò)直接與Myo9b啟動(dòng)子上的TCE位點(diǎn)結(jié)合而激活Myo9b基因表達(dá)。
　　3 KLF5缺失導(dǎo)致Myo9b表達(dá)下調(diào)及podosome形成減少
　　免疫熒光染色結(jié)果顯示，Myo9b與 podosome共定位。PDBu促進(jìn)WT巨噬細(xì)胞形成 podosome，但在 PDBu處理的 KLF5-/-巨噬細(xì)胞中podosome數(shù)量顯著減少。Podosome陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在TNF-α誘導(dǎo)的WT巨噬細(xì)胞

17、中顯著升高，但無(wú)論TNF-α誘導(dǎo)與否，KLF5-/-巨噬細(xì)胞中的podosome陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較少。Myo9b與Vinculin、Tks5或F-actin共定位的染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)， Myo9b定位于巨噬細(xì)胞的 podosome中。Myo9a不與Cortactin和F-actin在podosome中共定位。在KLF5-/-巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF5能夠恢復(fù)podosome的形成。體內(nèi)研究結(jié)果同樣證實(shí)，podosome結(jié)構(gòu)在人和小鼠AAA組織

18、中與體外細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)相似。
　　小結(jié)：
　　KLF5在巨噬細(xì)胞中缺失造成細(xì)胞遷移功能受損。在巨噬細(xì)胞中， Myo9b是KLF5的直接靶基因，KLF5通過(guò)直接與Myo9b啟動(dòng)子上的TCE位點(diǎn)相互作用激活Myo9b基因轉(zhuǎn)錄，KLF5缺失通過(guò)導(dǎo)致Myo9b表達(dá)下調(diào)而減少podosome形成。
　　第三部分 Myo9b通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)RhoA信號(hào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞podosome的形成、遷移和AAA進(jìn)展
　　目的：探索KLF5及受

19、其調(diào)控的Myo9b調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞podosome形成的分子機(jī)制。
　　方法：1用si-RNA敲低巨噬細(xì)胞中內(nèi)源性Myo9b的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光染色觀察podosome的形成是否發(fā)生變化。2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察Myo9b敲低對(duì)巨噬細(xì)胞侵襲能力的影響。3在Myo9b的巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF5后經(jīng)免疫熒光染色觀察podosome的形成。4用TNF-α刺激巨噬細(xì)胞后，GTPase pull-down和Western blot檢測(cè)

20、巨噬細(xì)胞中與GTP結(jié)合的RhoA、Cdc42和Rac1及其總蛋白水平。5在巨噬細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)或敲低KLF5，GTPase pull-down和Western blot檢測(cè)RhoA、Cdc42和Rac1的激活和Myo9b表達(dá)變化。6用上述方法檢查RhoA特異性抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞podosome形成和細(xì)胞遷移的影響。7免疫雙熒光染色和qRT-PCR檢測(cè)人AAA組織中Myo9b的表達(dá)和定位。
　　結(jié)果：
　　1 Myo9b敲低減少

21、TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞podosome的形成和遷移
　　用Myo9b特異性siRNA（si-Myo9b）和非特異性siRNA（si-NS）轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染si-NS的細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染 si-Myo9b的細(xì)胞中 PDBu誘導(dǎo)的 podosome形成顯著減少，而且Myo9b敲低后，podosome的形成不再受TNF-α的影響。Transwell結(jié)果顯示，Myo9b敲低后，穿越濾膜的巨噬細(xì)胞的數(shù)目顯著低于

22、轉(zhuǎn)染si-NS的細(xì)胞。反之，在巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF5能夠促進(jìn)podosome的形成，但是這種效應(yīng)在轉(zhuǎn)染si-Myo9b的巨噬細(xì)胞中被取消。
　　2在巨噬細(xì)胞中KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP水平
　　GTPase pull-down和Western blot結(jié)果顯示，在TNF-α刺激的巨噬細(xì)胞中，與GTP結(jié)合的Cdc42、Rac1和RhoA水平顯著增加，其中RhoA-GTP水平在30min達(dá)到峰值，6 h恢復(fù)至基礎(chǔ)水

23、平。與此同時(shí)，伴隨著RhoA-GTP水平的下降，Myo9b的表達(dá)水平增加。在巨噬細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)KLF5后，經(jīng)GTPase pull-down和Western blot檢查Myo9b表達(dá)及RhoA-GTP水平的變化。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)KLF5顯著上調(diào)Myo9b的表達(dá)，并且減少RhoA-GTP的水平；敲低KLF5顯著下調(diào)Myo9b的表達(dá)，增加RhoA-GTP的水平。免疫熒光結(jié)果顯示，與Rhosin處理的WT巨噬細(xì)胞相比，KLF5-/-巨噬

24、細(xì)胞經(jīng)Rhosin處理后，PDBu誘導(dǎo)形成的podosome數(shù)目顯著增多。Transwell結(jié)果顯示，與未經(jīng)處理的KLF5-/-巨噬細(xì)胞相比，Rhosin處理后細(xì)胞侵襲能力顯著增加。
　　3在人組織中Myo9b表達(dá)上調(diào)并且定位于巨噬細(xì)胞
　　免疫雙熒光染色結(jié)果顯示，人AAA組織中Myo9b的表達(dá)與正常組比較顯著升高，且主要定位于MAC2陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果表明， Myo9bmRNA水平在人AAA組織中顯著高于正

25、常腹主動(dòng)脈組織。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，KLF5mRNA水平與AAA的膨脹率的相關(guān)性并不明顯（P＞0.05），但是Myo9bmRNA水平與AAA的膨脹率具有顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。
　　小結(jié)：
　　敲低Myo9b能顯著減少TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞podosome的形成和遷移。在巨噬細(xì)胞中，KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP的水平；KLF5通過(guò)上調(diào)Myo9b表達(dá)而抑制RhoA信號(hào)途徑以及podosome的形成。巨噬細(xì)胞中