轉(zhuǎn)錄因子KLF5在腹主動脈瘤形成中的作用及機制研究.pdf

1、腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysms，AAA）是一種慢性炎癥性疾病，其病理特征是主動脈壁的重塑，常常由于主動脈夾層動脈瘤破裂而導致病人死亡。AAA的形成是與多種因素有關(guān)，包括巨噬細胞的浸潤，炎性因子和蛋白酶的釋放，彈力纖維的斷裂，血管平滑肌細胞的凋亡，膠原蛋白降解等，其中巨噬細胞浸潤在AAA的發(fā)病機理中具有重要作用。研究已經(jīng)報道，慢性炎癥狀態(tài)（包括動脈粥樣硬化、氧化應激、血管緊張素II和炎性細胞因子）激活單核

2、/巨噬細胞，被激活的巨噬細胞滲透到血管壁并釋放蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白和彈性蛋白；同時，浸潤進血管壁的巨噬細胞在血管中膜和外膜分泌炎性細胞因子，如：TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6，進一步加劇炎癥反應。
　　巨噬細胞浸潤至血管壁的過程需要肌動蛋白細胞骨架的重新組構(gòu)。在巨噬細胞浸潤過程中產(chǎn)生一種膜突出結(jié)構(gòu)：偽足小體（podosome）。目前已知，多種細胞結(jié)蛋白和信號蛋白以肌絲蛋白為核心包裹行成的束狀pod

3、osome參與細胞的局部黏附和遷移。束狀 podosome呈現(xiàn)為點狀的染色，壽命2-10 min左右，但在炎癥環(huán)境下，束狀podosome逐漸積聚變?yōu)榄h(huán)形podosome（稱為podosome rosette），這種結(jié)構(gòu)可持續(xù)數(shù)小時，持續(xù)進行細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）消化并促使細胞遷移。此外，podosome還包含多個信號蛋白，其中RhoA是podosome形成的一個關(guān)鍵信號分子。但是，目前關(guān)于pod

4、osome形成及其與巨噬細胞遷移的關(guān)系仍不清楚。
　　Myo9b作為一種與肌絲蛋白相關(guān)的馬達蛋白，其分子中包含的RhoGAP蛋白結(jié)構(gòu)域具有抑制Rho信號的作用，因而能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的極性和遷移。盡管Myo9b在破骨細胞中表達并調(diào)節(jié)podosome形成已有報道，但是Myo9b與動脈瘤發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系尚未闡明。
　　人類Krüppel樣因子5（KLF5）屬于SP/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族，其在羧基末端具有三個共同的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)

5、。大量研究表明KLF5可以激活多種與心血管重塑相關(guān)的基因。已有報道，KLF5在大型未破裂的腦動脈瘤中高度表達，但是KLF5介導AAA形成的確切機制尚不清楚。在AAA形成過程中，KLF5與 podosome形成和巨噬細胞浸潤的關(guān)系仍然未知。因此，本研究利用CaPO4誘導的小鼠腹主動脈瘤模型和人AAA組織，探討Myo9b在KLF5介導的巨噬細胞podosome形成和巨噬細胞浸潤中的作用，旨在為闡明KLF5在動脈瘤中的作用機制提供實驗基礎。<

6、br>　　第一部分 KLF5通過促進巨噬細胞的遷移參與腹主動脈瘤的形成
　　目的：探討KLF5對巨噬細胞遷移的影響及其在AAA形成中的作用。
　　方法：1通過實時定量PCR（qRT-PCR）和免疫組化檢測人AAA組織中KLF5的表達，免疫雙熒光共定位檢測KLF5在血管組織中巨噬細胞和VSMCs的表達。2構(gòu)建CaPO4誘導的小鼠AAA模型，HE染色證實模型成功。qRT-PCR和免疫組化檢測小鼠AAA組織中KLF5的表達。免疫雙

7、熒光共定位檢測KLF5在小鼠AAA組織巨噬細胞和VSMCs中的表達。3雜交培育骨髓源單核細胞KLF5基因特異性敲除小鼠并建立AAA模型。4 HE和EVG染色檢查血管組織和彈力纖維的變化。5免疫雙熒光共定位KLF5和巨噬細胞。
　　結(jié)果：
　　1人AAA組織中KLF5表達升高
　　與人正常主動脈組織相比，人AAA組織中KLF5mRNA表達水平升高，免疫組化KLF5染色陽性細胞數(shù)增加。對巨噬細胞和平滑肌細胞標志物進行免疫熒

8、光染色的結(jié)果顯示，在人AAA組織中巨噬細胞明顯增多，并且平滑肌細胞和巨噬細胞中KLF5表達均明顯增多，說明KLF5表達水平升高可能在AAA形成中發(fā)揮作用。
　　2 CaPO4誘導的小鼠AAA中KLF5表達水平增加
　　在形態(tài)學檢查證實，用CaPO4誘導成功建立小鼠AAA模型的基礎上，檢查KLF5在實驗型AAA組織中的表達變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，KLF5 mRNA表達水平隨著CaPO4誘導天數(shù)的增加而升高，在第7天和第1

9、4天分別升高了2.39倍和2.14倍。免疫熒光染色結(jié)果證實，KLF5在巨噬細胞和VSMCs中均有表達，這與在人AAA組織中的檢測結(jié)果相同。這些結(jié)果表明，KLF5參與人和小鼠AAA的形成。
　　3巨噬細胞特異性敲除KLF5能減緩CaPO4誘導的小鼠AAA形成
　　KLF5-flox小鼠和 LysM-cre小鼠雜交培育遺傳性敲除巨噬細胞中KLF5的小鼠（KLF5-/-），與野生型（WT）小鼠相比，KLF5-/-小鼠經(jīng)CaPO4誘

10、導的腹主動脈膨脹率顯著降低。HE染色結(jié)果顯示，KLF5-/-小鼠的腹主動脈組織結(jié)構(gòu)接近正常，彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。結(jié)果顯示KLF5-/-小鼠腹主動脈的彈力纖維斷裂與WT組比較明顯減少。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與WT組比較，在KLF5-/-小鼠的血管組織中，KLF5染色陽性巨噬細胞數(shù)量明顯減少。這些結(jié)果表明，KLF5通過促進巨噬細胞浸潤而參與AAA形成。
　　小結(jié)：
　　KLF5在人和CaPO4誘導的小鼠AAA組織中

11、表達升高。KLF5在血管平滑肌細胞和巨噬細胞中均進行表達。巨噬細胞特異性敲除KLF5能夠減少巨噬細胞的浸潤，抑制CaPO4誘導的小鼠AAA的形成。
　　第二部分 KLF5通過上調(diào)Myo9b表達促進巨噬細胞podosome的形成和遷移
　　目的：揭示 KLF5促進巨噬細胞遷移和浸潤的分子與細胞生物學機制。
　　方法：1體外細胞劃痕實驗觀察 WT和 KLF5-/-巨噬細胞的遷移。2 Transwell小室實驗觀察WT和KL

12、F5-/-巨噬細胞的侵襲能力。3掃描電鏡觀察巨噬細胞跨膜遷移時細胞足突。4活細胞工作站觀察 WT和 KLF5-/-巨噬細胞的徑向運動變化。5 mRNA表達譜芯片檢測WT和KLF5-/-巨噬細胞的基因表達差異。6 qRT-PCR檢測細胞運動相關(guān)基因的表達。7在巨噬細胞中過表達和敲低KLF5后檢查運動相關(guān)基因的表達變化。8報告基因檢測KLF5對Myo9b基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。9 Oligo pull-down分析確定KLF5在Myo9b基因

13、啟動子上的結(jié)合位點。
　　結(jié)果：
　　1 KLF5-/-巨噬細胞的遷移功能受損
　　從KLF5-/-和WT小鼠分離培養(yǎng)骨髓源巨噬細胞，劃痕實驗結(jié)果表明， KLF5-/-巨噬細胞的遷移進入劃痕區(qū)域的細胞數(shù)量比 WT巨噬細胞顯著減少。Transwell小室實驗證實，與WT巨噬細胞相比，KLF5-/-巨噬細胞的侵襲能力受損。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，與WT巨噬細胞相比，KLF5-/-巨噬細胞具有更少、更短的突觸和偽足。細胞免疫雙

14、熒光染色結(jié)果顯示，跨越濾膜的KLF5-/-巨噬細胞幾乎不表達KLF5。進一步用動態(tài)細胞成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，與WT巨噬細胞相比，KLF5-/-巨噬細胞的徑向遷移能力受損，遷移速率明顯降低。
　　2 KLF5通過直接與Myo9b啟動子結(jié)合而上調(diào)Myo9b表達
　　mRNA表達譜芯片檢測結(jié)果顯示，與 WT組比較，KLF5-/-小鼠的運動相關(guān)基因在CaPO4損傷的主動脈組織中表達顯著下降。Gene Ontology富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表

15、達的基因主要集中于細胞 Myosin肌絲和 Myosin復合物等蛋白相關(guān)基因。qRT-PCR對芯片分析結(jié)果進行驗證，Myo9a、Myo9b和Macf1基因表達在KLF5-/-小鼠顯著下調(diào)。分別在Raw264.7中過表達或敲低 KLF5，PCR和 Western blotting結(jié)果均顯示，在基礎水平和TNF-α誘導情況下，在巨噬細胞中過表達或敲低KLF5均能夠顯著增加或降低Myo9a和Myo9b的mRNA和蛋白水平。報告基因和Oligo

16、 pull-down分析結(jié)果表明，KLF5通過直接與Myo9b啟動子上的TCE位點結(jié)合而激活Myo9b基因表達。
　　3 KLF5缺失導致Myo9b表達下調(diào)及podosome形成減少
　　免疫熒光染色結(jié)果顯示，Myo9b與 podosome共定位。PDBu促進WT巨噬細胞形成 podosome，但在 PDBu處理的 KLF5-/-巨噬細胞中podosome數(shù)量顯著減少。Podosome陽性細胞數(shù)在TNF-α誘導的WT巨噬細胞

17、中顯著升高，但無論TNF-α誘導與否，KLF5-/-巨噬細胞中的podosome陽性細胞數(shù)均較少。Myo9b與Vinculin、Tks5或F-actin共定位的染色結(jié)果進一步證實， Myo9b定位于巨噬細胞的 podosome中。Myo9a不與Cortactin和F-actin在podosome中共定位。在KLF5-/-巨噬細胞中過表達KLF5能夠恢復podosome的形成。體內(nèi)研究結(jié)果同樣證實，podosome結(jié)構(gòu)在人和小鼠AAA組織

18、中與體外細胞中的結(jié)構(gòu)相似。
　　小結(jié)：
　　KLF5在巨噬細胞中缺失造成細胞遷移功能受損。在巨噬細胞中， Myo9b是KLF5的直接靶基因，KLF5通過直接與Myo9b啟動子上的TCE位點相互作用激活Myo9b基因轉(zhuǎn)錄，KLF5缺失通過導致Myo9b表達下調(diào)而減少podosome形成。
　　第三部分 Myo9b通過負性調(diào)節(jié)RhoA信號促進巨噬細胞podosome的形成、遷移和AAA進展
　　目的：探索KLF5及受

19、其調(diào)控的Myo9b調(diào)節(jié)巨噬細胞podosome形成的分子機制。
　　方法：1用si-RNA敲低巨噬細胞中內(nèi)源性Myo9b的表達，細胞免疫熒光染色觀察podosome的形成是否發(fā)生變化。2 Transwell小室實驗觀察Myo9b敲低對巨噬細胞侵襲能力的影響。3在Myo9b的巨噬細胞中過表達KLF5后經(jīng)免疫熒光染色觀察podosome的形成。4用TNF-α刺激巨噬細胞后，GTPase pull-down和Western blot檢測

20、巨噬細胞中與GTP結(jié)合的RhoA、Cdc42和Rac1及其總蛋白水平。5在巨噬細胞中分別過表達或敲低KLF5，GTPase pull-down和Western blot檢測RhoA、Cdc42和Rac1的激活和Myo9b表達變化。6用上述方法檢查RhoA特異性抑制劑對巨噬細胞podosome形成和細胞遷移的影響。7免疫雙熒光染色和qRT-PCR檢測人AAA組織中Myo9b的表達和定位。
　　結(jié)果：
　　1 Myo9b敲低減少

21、TNF-α誘導的巨噬細胞podosome的形成和遷移
　　用Myo9b特異性siRNA（si-Myo9b）和非特異性siRNA（si-NS）轉(zhuǎn)染巨噬細胞，細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染si-NS的細胞相比，在轉(zhuǎn)染 si-Myo9b的細胞中 PDBu誘導的 podosome形成顯著減少，而且Myo9b敲低后，podosome的形成不再受TNF-α的影響。Transwell結(jié)果顯示，Myo9b敲低后，穿越濾膜的巨噬細胞的數(shù)目顯著低于

22、轉(zhuǎn)染si-NS的細胞。反之，在巨噬細胞中過表達KLF5能夠促進podosome的形成，但是這種效應在轉(zhuǎn)染si-Myo9b的巨噬細胞中被取消。
　　2在巨噬細胞中KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP水平
　　GTPase pull-down和Western blot結(jié)果顯示，在TNF-α刺激的巨噬細胞中，與GTP結(jié)合的Cdc42、Rac1和RhoA水平顯著增加，其中RhoA-GTP水平在30min達到峰值，6 h恢復至基礎水

23、平。與此同時，伴隨著RhoA-GTP水平的下降，Myo9b的表達水平增加。在巨噬細胞中敲低或過表達KLF5后，經(jīng)GTPase pull-down和Western blot檢查Myo9b表達及RhoA-GTP水平的變化。結(jié)果表明，過表達KLF5顯著上調(diào)Myo9b的表達，并且減少RhoA-GTP的水平；敲低KLF5顯著下調(diào)Myo9b的表達，增加RhoA-GTP的水平。免疫熒光結(jié)果顯示，與Rhosin處理的WT巨噬細胞相比，KLF5-/-巨噬

24、細胞經(jīng)Rhosin處理后，PDBu誘導形成的podosome數(shù)目顯著增多。Transwell結(jié)果顯示，與未經(jīng)處理的KLF5-/-巨噬細胞相比，Rhosin處理后細胞侵襲能力顯著增加。
　　3在人組織中Myo9b表達上調(diào)并且定位于巨噬細胞
　　免疫雙熒光染色結(jié)果顯示，人AAA組織中Myo9b的表達與正常組比較顯著升高，且主要定位于MAC2陽性的巨噬細胞。qRT-PCR結(jié)果表明， Myo9bmRNA水平在人AAA組織中顯著高于正

25、常腹主動脈組織。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，KLF5mRNA水平與AAA的膨脹率的相關(guān)性并不明顯（P＞0.05），但是Myo9bmRNA水平與AAA的膨脹率具有顯著正相關(guān)性（P＜0.05）。
　　小結(jié)：
　　敲低Myo9b能顯著減少TNF-α誘導的巨噬細胞podosome的形成和遷移。在巨噬細胞中，KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP的水平；KLF5通過上調(diào)Myo9b表達而抑制RhoA信號途徑以及podosome的形成。巨噬細胞中