miR-199A-5p在慢性缺氧心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　慢性低氧是紫紺型先天性心臟病(cyanotic congenital heart defect，CCHD)患者的主要病理生理特征之一，同時(shí)也見(jiàn)于一些慢性缺血缺氧性心臟病。在長(zhǎng)期的低氧條件下，心肌組織可以對(duì)低氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)，從而維持心肌細(xì)胞存活，確保心臟的功能，患者往往可以存活數(shù)年甚至更長(zhǎng)時(shí)間，而不發(fā)生心力衰竭。探明心肌細(xì)胞對(duì)慢性低氧適應(yīng)的機(jī)制，對(duì)于CCHD及缺血缺氧性心臟病的診斷、治療尤其是CCHD患兒圍手術(shù)期針對(duì)性的

2、心肌保護(hù)具有重要的臨床意義，但目前對(duì)此機(jī)制了解尚不完全。本科室既往研究發(fā)現(xiàn)CCHD患兒心肌細(xì)胞在慢性缺氧后引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor6，ATF6）信號(hào)途徑的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力得以緩解，避免心肌細(xì)胞損傷和凋亡，起到保護(hù)心肌細(xì)胞

3、的重要作用。另一方面，本課題組過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)紫紺型先心病心肌組織在缺氧時(shí)激活炎癥免疫反應(yīng)導(dǎo)致STAT3信號(hào)活化，參與了對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。本課題在前期研究基礎(chǔ)上，圍繞miR-199a-5p，及其潛在的靶基因，ATF6和78-kD葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(78-kD glucose-regulated protein，GRP78)在心肌慢性缺氧時(shí)可能的調(diào)控作用開(kāi)展了深入研究，同時(shí)，對(duì)缺氧時(shí)炎癥免疫機(jī)制引起STAT3活化這一重要信號(hào)通路是否參與促進(jìn)了

4、miR-199a-5p的表達(dá)下調(diào)，也進(jìn)行了研究探索。
　　方法：
　　第一部分
　　收集紫紺型先天性心臟病與非紫紺型先天性心臟病(Acyanotic congenitalheart defects，ACHD)臨床患者手術(shù)中切除的心肌組織，分析ATF6（p50與p90片段）、GRP78的蛋白與mRNA表達(dá)情況，檢測(cè)心肌組織miR-199a-5p的水平，并進(jìn)行其與心肌ATF6與GRP78表達(dá)水平，以及患者血氧飽和度之間的相

5、關(guān)性分析。
　　第二部分
　　利用低氧培養(yǎng)的人心肌細(xì)胞株(Human Cardiac Myocyte，HCM)作為研究模型，進(jìn)行常氧與低氧培養(yǎng)，通過(guò)microRNA模擬物miR-199a-5p mimic與抑制物miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染干預(yù)細(xì)胞中miR-199a-5p的水平后，檢測(cè)ATF6、GRP78的蛋白與mRNA表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)AnnexinⅤ陽(yáng)性的細(xì)胞凋亡率并觀察ERS凋亡相關(guān)蛋白CH

6、OP的表達(dá)情況，應(yīng)用雙熒光素報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)研究在HEK293T細(xì)胞及常氧和低氧培養(yǎng)的HCM細(xì)胞中，miR-199a-5p對(duì)ATF6和GRP78的3'-UTR區(qū)的靶向作用情況。
　　第三部分
　　檢測(cè)CCHD與ACHD患兒心肌組織中白介素(Interleukin，IL)-6和IL-11的表達(dá)及STAT3磷酸化情況。將Balb/c小鼠在相當(dāng)于正常大氣50％氧含量條件下的低壓低氧艙中暴露7天和21天，同時(shí)腹腔注射S3I-201干預(yù)S

7、TAT3信號(hào)的激活，檢測(cè)對(duì)miR-199a-5p水平及其前體原始microRNA即pri-miR-199a-1和pri-miR-199a-2表達(dá)的影響。利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)，研究pSTAT3與pri-miR-199a啟動(dòng)子區(qū)的作用情況。此外，還觀察了缺氧小鼠注射S3I-201干預(yù)STAT3活化后，以及同時(shí)注射miR-199a-5p antagomir抑制miR-199a-5p的水平對(duì)心肌中miR-199a-5p靶基因AT

8、F6與GRP78的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CCHD患者心肌組織中miR-199a-5p與GRP78、ATF6的表達(dá)存在相關(guān)性
　　利用手術(shù)中收集的心臟組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CCHD患者心肌組織中miR-199a-5p的水平顯著低于ACHD患者，低氧后miR-199a-5p的降低與患者血氧飽和度的降低存在顯著的正相關(guān)性。CCHD患者心肌組織中ATF6、GRP78的mRNA和蛋白表達(dá)水平相對(duì)ACHD較高。同時(shí)，

9、CCHD患兒心肌組織中miR-199a-5p的水平與ATF6、GRP78的表達(dá)水平存在顯著的負(fù)相關(guān)性。
　　2.低氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中miR-199a-5p下調(diào)可促進(jìn)GRP78和ATF6的表達(dá)
　　通過(guò)建立人心肌細(xì)胞(HCM)的不同氧濃度（3％ O2和1％ O2）低氧培養(yǎng)模型，我們發(fā)現(xiàn)與常氧培養(yǎng)相比，中度低氧(3％O2)培養(yǎng)的HCM細(xì)胞ATF6、GRP78表達(dá)增加，UPR增強(qiáng)，細(xì)胞未發(fā)生明顯的凋亡反應(yīng)，最接近CCHD患兒慢性低

10、氧后能生存及心肌細(xì)胞未嚴(yán)重受損的實(shí)際情況。而1％ O2培養(yǎng)的HCM細(xì)胞雖然ATF6、GRP78表達(dá)也增加，但細(xì)胞出現(xiàn)了較嚴(yán)重的凋亡，因此在3％ O2條件下培養(yǎng)HCM細(xì)胞被作為我們模擬CCHD心肌細(xì)胞的體外研究模型。
　　與常氧相比，持續(xù)的中度低氧(3％O2)可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞miR-199a-5p水平數(shù)倍的降低。當(dāng)將miR-199a-5pmimic轉(zhuǎn)染至3％ O2低氧培養(yǎng)的HCM中，則ATF6和GRP78的表達(dá)水平顯著降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

11、激相關(guān)凋亡分子CHOP的表達(dá)和AnnexinⅤ+細(xì)胞凋亡率顯著增高，而miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致缺氧HCM細(xì)胞ATF6和GRP78表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)和凋亡率進(jìn)一步降低。上述結(jié)果提示心肌細(xì)胞低氧時(shí)miR-199a-5p的下調(diào)對(duì)ATF6和GRP78的表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用。
　　我們通過(guò)構(gòu)建含有ATF6和GRP78mRNA3'-UTR區(qū)miR-199a-5p潛在結(jié)合位點(diǎn)（野生型和突變型）序列的雙熒光素報(bào)告載體，與

12、miR-199a-5pmimic一起轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞和HCM細(xì)胞，通過(guò)熒光素檢測(cè)證明了miR-199a-5p對(duì)ATF6和GRP78的3'-UTR區(qū)具有直接的靶向結(jié)合作用，且在HCM心肌細(xì)胞中這種靶向調(diào)控作用相比于HEK293T細(xì)胞具有一定的組織細(xì)胞性優(yōu)勢(shì)。另外，通過(guò)雙熒光素報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)也證明，HCM細(xì)胞低氧培養(yǎng)時(shí)，由于內(nèi)源性miR-199a-5p的水平降低，會(huì)導(dǎo)致miR-199a-5pmimic對(duì)ATF6和GRP78的3'-UT

13、R區(qū)的靶向作用減弱。
　　3.低氧時(shí)心肌細(xì)胞STAT3信號(hào)的活化促進(jìn)了miR-199a-5p的水平下調(diào)
　　與非紫紺組相比，紫紺型先心病組心肌組織中pSTAT3/STAT3表達(dá)比值顯著增高，顯示STAT3信號(hào)活化。同時(shí)，紫紺型先心病患兒心肌組織勻漿中IL-6、IL-11的表達(dá)水平顯著高于非紫紺組，提示低氧通過(guò)誘導(dǎo)IL-6、IL-11等因子的生成激活心肌細(xì)胞STAT3信號(hào)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)CCHD患者心肌IL-6、IL-11的水

14、平與miR-199a-5p的水平呈顯著的負(fù)相關(guān)性。
　　小鼠低氧暴露7天和21天時(shí)miR-199a-5p的水平相比常氧小鼠出現(xiàn)數(shù)倍的降低，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低氧導(dǎo)致miR-199a-5p的降低主要與其前體原始microRNA分子pri-miR-199a-2（而非pri-miR-199a-1）的表達(dá)降低有關(guān)。若小鼠在接受低氧處理同時(shí)腹腔注射STAT3特異性抑制劑S3I-201，則miR-199a-5p和pri-miR-199a-

15、2的降低被顯著阻礙。利用常氧與低氧下小鼠的心肌組織進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，pSTAT3可以與pri-miR-199a-2的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行結(jié)合，且低氧時(shí)這種結(jié)合性顯著增強(qiáng)。
　　小鼠低氧后導(dǎo)致心肌組織ATF6和GRP78的表達(dá)增高，但注射S3I-201干預(yù)STAT3信號(hào)后，在miR-199a-5p的水平下降被抑制的同時(shí)，miR-199a-5p靶基因ATF6和GRP78的表達(dá)增高也被抑制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白CHOP的表達(dá)增高，提示細(xì)胞

16、凋亡增多。另外，在干預(yù)STAT3信號(hào)同時(shí)如果同時(shí)給予miR-199a-5p antagomir注射抑制miR-199a-5p的水平，則ATF6和GRP78的表達(dá)相對(duì)于單獨(dú)干預(yù)STAT3時(shí)增強(qiáng)，凋亡分子CHOP的表達(dá)可相對(duì)被抑制。
　　結(jié)論：
　　綜合本研究結(jié)果，CCHD患者心肌細(xì)胞在長(zhǎng)期低氧作用下，尤其是在低氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞炎癥免疫機(jī)制激活引起STAT3信號(hào)活化的情況下，miR-199a-5p的表達(dá)水平會(huì)顯著降低，導(dǎo)致其靶基