OATP1B1及CYP2C9基因多態(tài)性對氟伐他汀轉運代謝影響的分子機制研究.pdf

1、背景:
　　氟伐他汀是第一個全化學合成的降膽固醇藥物，是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，適用于原發(fā)性高膽固醇及原發(fā)性混合型血脂異常等疾病。CYP2C9為氟伐他汀體內(nèi)代謝的主要亞酶，OATP1B1則是氟伐他汀進入肝細胞的轉運體。研究顯示CYP2C9和OATP1B1的遺傳變異均直接影響其生理功能，那么此遺傳變異是否造成氟伐他汀的代謝轉運的變化，從而引起氟伐他汀療效和副作用的改變，確實令人關注。故有必要圍繞

2、CYP2C9及OATP1B1基因多態(tài)性對氟伐他汀的代謝轉運影響展開系統(tǒng)研究，為氟伐他汀的合理應用提供理論與實驗依據(jù)。
　　目的:
　　本課題擬通過構建野生型及突變型CYP2C9重組酶，研究CYP2C9基因多態(tài)性對氟伐他汀代謝的影響;同時通過構建OATP1B1*5、*1a和*15重組質(zhì)粒模型，研究OATP1B1基因多態(tài)性對氟伐他汀轉運的影響。綜合分析CYP2C9及OATP1B1基因多態(tài)性對氟伐他汀基于轉運代謝影響可能引起的臨床

3、療效的改變。更好的服務于臨床個體化治療。
　　方法:
　　1、摸索和建立氟伐他汀重組酶的生物樣本處理和HPLC檢測方法。
　　2、建立氟伐他汀在重組酶中的孵育方法。
　　3、氟伐他汀在不同基因型CYP2C9重組酶中體外酶促動力學分析。實驗分為空白對照組、CYP2C9*1、CYP2C9*3重組酶組，通過溫孵時間、重組酶濃度、底物濃度三個方面來考察氟伐他汀在野生型和突變體重組酶的代謝動力學特征。采用建立的HPLC法測

4、定重組酶體系中氟伐他汀及其代謝產(chǎn)物的量，比較氟伐他汀在CYP2C9野生型與突變體之間的代謝動力學性質(zhì)，并采用米氏方程比較氟伐他汀在野生型和突變體重組酶的代謝動力學參數(shù)VmaxKm、Clint等。
　　4、建立氟伐他汀HEK293T細胞的生物樣本處理和LC-MS檢測方法。
　　5、系統(tǒng)展開HEK293T、OATP1B1*5、*1a和*15細胞的培養(yǎng)、傳代及MTT試驗。
　　6、氟伐他汀在表達OATP1B1*5、OATP1

5、B1*1a及*15的HEK293T細胞中吸收轉運實驗分中為空白對照組、OATP1B1*1a、OATP1B1*5與OATP1B1*15質(zhì)粒組，通過按不同時間點考察對攝取過程的影響;通過按不同酶濃度點考察對攝取過程的影響;通過每組分別加入系列濃度的氟伐他汀，考察底物濃度對攝取過程的影響。采用建立的LC-MS法測定HEK293T細胞樣本中氟伐他汀濃度，考察三種不同基因型質(zhì)粒模型中氟伐他汀的攝取動力學過程及其動力學參數(shù)(Km、Vmax、CLin

6、t值)，分析兩個突變位點對氟伐他汀轉運的影響。
　　7、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。統(tǒng)計分析采用SPSS12.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，P＜0.05為具有顯著性差異，P＞0.05為無顯著性差異，P＜0.01為具有極顯著性差異。
　　結果:
　　1、建立的HPLC檢測方法完全能夠符合重組酶樣品的分析測試的要求，具有高靈敏度。定量下限為0.5uM。
　　2、建立的氟伐他汀在CYP2C9重

7、組酶中的孵育方法以及樣品處理方法完全能夠符合本課題的要求。此方法在多次實驗中成功驗證，已穩(wěn)定建立。
　　3、CYP2C9*1酶促動力學參數(shù)Km、Vmax及CLint值分別為8.96±0.76 uM、11.2±2.11 pmol/min/pmol、1.25;突變型CYP2C9*3酶促動力學參數(shù)Km、Vmax及CLint值分別為1.91±0.32uM、0.81±0.02pmol/min/pmol P450、0.42，通過比較野生型CY

8、P2C9*1和突變型CYP2C9*3重組酶的酶促動力學參數(shù)Km、Vmax及CLint值，統(tǒng)計分析得出(P＜0.01)，說明突變型CYP2C9*3代謝氟伐他汀的活性明顯小于野生型CYP2C9*1。
　　4、成功的建立了氟伐他汀細胞樣品處理方法及細胞樣品的LC-MS分析檢測方法，具有高靈敏度和特異性。定量下限為1.0nmol/L。
　　5、HEK293T、OATP1B1*5及OATP1B1*15細胞生長良好，形態(tài)大小均一，邊界輪

9、廓清晰，胞漿透亮，可見細胞核。通過MTT試驗確定氟托伐他汀在1-150uM范圍內(nèi)對HEK293T細胞毒性小。
　　6、OATP1B1*5-HEK293T對氟伐他汀攝取的動力學參數(shù)Km、Vmax及CLint分別為12.35±1.32uM、3.27±0.53pmol·min-1·mg-1protein、0.26; OATP1B1*15-HEK293T對氟伐他汀攝取的動力學參數(shù)Km、Vmax及CLint分別為18.21±1.72uM、6

10、.88±2.01pmol·min-1·mg-1 protein、0.38; OATP1B1*1a-HEK293T對氟伐他汀攝取的動力學參數(shù)Km、Vmax及CLint分別為17.46±2.05uM、6.32±1.23 pmol·min-1·mg-1protein、0.36。通過比較攝取動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)OATP1B1*1a與OATP1B1*5統(tǒng)計學分析(P＜0.05)，差異非常顯著。結果表明OATP1B1*5基因?qū)Ψニ〉霓D運能力明顯低于

11、OATP1B1*1a野生型。
　　結論:
　　1、研究表明，CYP2C9*3（突變型）代謝氟伐他汀的能力較CYP2C9*1（野生型）明顯減弱，提示CYP2C9的基因多態(tài)性對氟伐他汀的代謝轉化影響顯著;
　　2、研究表明，OATP1B1*5（突變型）對氟伐他汀的轉運活性較OATP1B1*1a（野生型）降低，提示OATP1B1的基因多態(tài)性對氟伐他汀的轉運功能影響確切;
　　3、實驗結果提示，CYP2C9*3突變的患者