ApoE基因多態(tài)性對氟伐他汀抑制HMg-CoA還原酶影響及分子機制的研究.pdf

1、背景：ApoE是血漿脂蛋白的重要成分，通過與LDL受體結(jié)合調(diào)節(jié)著體內(nèi)的血脂水平。臨床研究報道，ApoE的基因多態(tài)性對他汀類藥物調(diào)節(jié)血脂的療效有明顯影響;而另有研究結(jié)果則提示阿托伐他汀調(diào)脂效應(yīng)的差異似與ApoE基因多態(tài)性無關(guān)，孰是孰非尚需更多的研究證據(jù)予以評判。值得重視的是，ApoE與LDL受體結(jié)合參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，而他汀類藥物抑制膽固醇合成的限速酶----HMG-CoA還原酶調(diào)節(jié)血脂，兩條完全不同的作用途徑如何產(chǎn)生影響和關(guān)聯(lián)更加令人關(guān)注

2、。因此，我們試圖以ApoE基因多態(tài)性為切入點，運用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究方式，探究ApoE的基因多態(tài)性對他汀類藥物調(diào)脂效應(yīng)的確切影響及其分子機制，為他汀類藥物調(diào)血脂作用的研究拓展新思路。
　　目的：通過比較不同基因亞型ApoE與LDL競爭性結(jié)合的差異，分析ApoE調(diào)脂效應(yīng)的作用位點;采用RT-PCR檢測HMG-CoA還原酶mRNA表達，比較不同基因亞型ApoE對氟伐他汀、丹參素及兩者聯(lián)合應(yīng)用抑制HMG-CoA還原酶的影響;探討A

3、poE基因多態(tài)性對氟伐他汀抑制HMG-CoA還原酶的確切影響位點及分子機制。
　　方法：⑴ApoE競爭性結(jié)合實驗:建立HSF細(xì)胞模型，系統(tǒng)摸索LDL與LDL受體結(jié)合時間、LDL濃度等最佳實驗條件;制備不同基因亞型的ApoE-DMPC復(fù)合體;建立ELISA檢測方法，用來檢測不同基因亞型ApoE-DMPC復(fù)合體與LDL競爭性結(jié)合而置換的LDL量。⑵HMG-CoA還原酶mRNA表達實驗:建立L-02細(xì)胞模型，系統(tǒng)摸索細(xì)胞培養(yǎng)血清、藥物作

4、用時間和ApoE濃度等最佳實驗條件;采用RT-PCR檢測L-02細(xì)胞中HMG-CoA還原酶mRNA表達量，表達量以灰度值比表示。⑶通過ApoE競爭性受體結(jié)合實驗，觀察ApoE2（Arg112→Cys）(突變型E2)、ApoE3(野生型E3)、ApoE4（Cys158→Arg）（突變型E4）三種基因亞型ApoE-DMPC復(fù)合體與LDL競爭性結(jié)合活性的差異。⑷通過RT-PCR檢測HMG-CoA還原酶mRNA表達量，考察野生型E3、突變型E2

5、、突變型E4三種基因亞型分別對氟伐他汀、丹參素、氟伐他汀與丹參素聯(lián)合應(yīng)用抑制HMG-CoA還原酶表達的影響;綜合分析ApoE基因多態(tài)性對氟伐他汀抑制HMG-CoA還原酶影響的位點及分子機制。⑸數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。通過雙倒數(shù)作圖法計算IC50;抑制率=（空白組灰度值比-實驗組灰度值比）/空白組灰度值比×100％;所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，多樣本組間差異采用方差齊性檢驗，兩兩比較

6、采用獨立樣本t檢驗。統(tǒng)計結(jié)果以P＞0.05表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。
　　結(jié)果：①本研究建立的ELISA檢測LDL方法靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度均符合實驗要求。線性范圍為0.2-12.8μg/ml。競爭性受體結(jié)合實驗的最佳結(jié)合時間為120min、LDL與受體的結(jié)合量為1.59±0.07μg/mg protein。LDL在濃度范圍為2-50μg/ml時與受體的結(jié)合量呈線性增加。

7、②血清培養(yǎng)的L-02細(xì)胞中，RT-PCR檢測HMG-CoA還原酶mRNA表達灰度值比為0.38±0.02，無血清誘導(dǎo)24h后的灰度值比上升到0.86±0.01。而氟伐他汀作用L-02細(xì)胞24h時，HMG-CoA還原酶mRNA灰度值比0.49±0.01。最適實驗條件為血清培養(yǎng)24h。野生型E3、突變型E2、突變型E4的實驗濃度分別為0.36、0.50、0.63μg/ml。③野生型E3、突變型E2、突變型E4三種基因亞型與LDL競爭性結(jié)合的

8、LDL最大置換量分別為6.84±0.23，3.92±0.40，6.30±0.32μg/mg protein;IC50分別為0.05±0.01，0.35±0.02，0.24±0.01μg/ml，方差齊性檢驗顯示三組間有顯著性差異(P＜0.05)，突變型E2、E4與野生型E3兩兩比較，差別有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01，P＜0.01)，兩種突變型E2、E4受體結(jié)合活性低于野生型E3，且突變型E2受體結(jié)合活性低于突變型E4(P＜0.01)。④系列

9、濃度的氟伐他汀、丹參素對HMG-CoA還原酶mRNA表達抑制的IC50分別為1.62±0.11、3.00±0.14;IC50對應(yīng)的HMG-CoA還原酶表達的抑制率分別為24.13±0.20％、15.11±0.31％;最大抑制率分別為48.26±0.40％、30.21±0.62％，可見氟伐他汀、丹參素均能顯著抑制HMG-CoA還原酶，且氟伐他汀抑制作用更強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。合用1.62μg/ml氟伐他汀與3.00μg/m

10、l丹參素時，看到其對HMG-CoA還原酶mRNA表達的抑制率為34.61±0.45％，比單用氟伐他?。?4.13±0.20％）、單用丹參素（15.11±0.31％）的酶抑制率明顯增大，t檢驗顯示差異顯著(P＜0.01);明確的顯示了抑制HMG-CoA還原酶活性的協(xié)同效應(yīng)。⑤當(dāng)加入野生型E3、突變型E2和E4時，氟伐他?。↖C50濃度1.62μg/ml）對HMG-CoA還原酶的抑制率分別為18.59±1.09％、23.49±0.37％、1

11、2.13±0.91％，均小于未加入ApoE組。將野生型E3組與未加ApoE相比，其HMG-CoA還原酶抑制率有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);而突變型E2組和突變型E4組的差異則不相同(P＞0.05，P＜0.01);突變型E4組與野生型E3組二者比較顯示氟伐他汀對HMG-CoA還原酶抑制率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);由此可見，ApoE2112位Arg突變?yōu)镃ys似與氟伐他汀對HMG-CoA還原酶抑制率的變化無關(guān)。當(dāng)加入野生型E3、突

12、變型E2和E4時，丹參素(IC50，3.00μg/ml)對HMG-CoA還原酶mRNA表達的抑制率分別為9.94±1.05％、6.54±0.47％、22.46±1.21％。野生型E3組和突變型E2組HMG-CoA還原酶抑制率小于未加ApoE組，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而突變型E4組的結(jié)果則相反: HMG-CoA還原酶明顯增大，與野生型E3組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01);由此可見，ApoE4158位

13、Cys突變似可增強丹參素對HMG-CoA還原酶的抑制效應(yīng)。⑥當(dāng)加入野生型E3、突變型E2和E4時，聯(lián)合作用1.62μg/ml氟伐他汀與3.00μg/ml丹參素對HMG-CoA還原酶mRNA表達的抑制率分別為24.68±2.63％、11.08±1.38％、33.69±1.65％。野生型E3組和突變型E2組HMG-CoA還原酶抑制率小于未加ApoE組;差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而突變型E4組的比較結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.

14、05)，這可能與ApoE4158位Cys突變增強丹參素抑酶效應(yīng)有關(guān)。
　　結(jié)論：⑴ApoE2112位Arg（精氨酸）突變?yōu)镃ys（半胱氨酸）及ApoE4158位Cys突變?yōu)锳rg均會導(dǎo)致受體結(jié)合活性比野生型E3更低，但突變型ApoE2與野生型E3之間的差異比突變型E4與野生型E3之間的差異更大，突變型E2與突變型E4之間差異有統(tǒng)計學(xué)差異。提示112位為ApoE的主要突變位點。⑵氟伐他汀與丹參素均有抑制HMG-CoA還原酶表達的作用

15、，且氟伐他汀比丹參素抑制作用更強;氟伐他汀與丹參素聯(lián)合應(yīng)用時抑制HMG-CoA還原酶具有協(xié)同效應(yīng)。⑶氟伐他汀抑制HMG-CoA還原酶mRNA表達作用與ApoE2112位Arg突變?yōu)镃ys無關(guān)，丹參素抑制HMG-CoA還原酶mRNA表達作用與ApoE4158位Cys突變?yōu)锳rg有關(guān)聯(lián);與無ApoE相比，突變型E2、突變型E4存在時，氟伐他汀與丹參素抑制酶表達作用大部分表現(xiàn)為減小。由此可以推論，ApoE112和158位點的突變而導(dǎo)致的LDL

16、置換量的降低會減小氟伐他汀及丹參素對HMG-CoA還原酶表達的抑制作用。⑷實驗結(jié)果進一步說明，氟伐他汀與丹參素聯(lián)合應(yīng)用時，野生型E3組和突變型E2組HMG-CoA還原酶抑制率小于未加ApoE組;而突變型E4組與無ApoE時差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與ApoE4158位Cys突變增強丹參素抑酶效應(yīng)有關(guān)。⑸ApoE112位和158位基因突變時，均會導(dǎo)致氟伐他汀與丹參素抑制HMG-CoA還原酶的作用發(fā)生變化。故氟伐他汀與丹參素在臨床用藥時應(yīng)密切