復方貞術調脂方基于HMG-CoA還原酶的降脂作用機制及藥效物質基礎研究.pdf

1、中藥復方是中醫(yī)治療疾病時整體觀的具體體現(xiàn)，是在辨證審因決定治法之后，選擇合適的藥物，酌定用量，按照“君、臣、佐、使”，“七情相合”的關系配伍而成；其作用機制是通過復方中各效應成分對機體的多個環(huán)節(jié)予與調節(jié)，進而達到整體治療疾病的目的。中藥復方的核心問題是藥效物質基礎、作用機制和配伍規(guī)律，這既受到學術界公認，亦是中醫(yī)藥基礎理論研究的熱點和難點問題。 復方貞術調脂方(FTZ)是導師郭姣教授多年的臨床實踐經(jīng)驗方，具有健脾益腎、化痰祛瘀、

2、涼血解毒的功效，并獲得專利授權。前期研究表明，該方具有降低血TC、TG、LDL-C和升高HDL-C等作用，且能夠上調脂代謝過程中的兩個關鍵酶—HMG-COA還原酶、ACO mRNA的表達水平，調脂作用優(yōu)于脂必妥，與血脂康、非諾貝特作用相似，且無不良反應。在此工作基礎上，本課題擬對復方貞術調脂方的降脂作用機制及藥效物質基礎做進一步的研究。 目的：高脂血癥是一個復雜、多因素的多靶點疾病，與遺傳和飲食環(huán)境等因素都有密切的關系。本課題采

3、用基因芯片技術先研究復方貞術調脂方對高脂血癥大鼠基因表達譜的影響，發(fā)現(xiàn)影響脂代謝的關鍵基因，再對該基因的表達、活性和功能進行研究；其次，將對該靶點作用的有效成分采用分子競爭抑制實驗（受體-配體結合實驗），結合現(xiàn)代分離、純化及分析技術對復方貞術調脂方中通過該靶點產(chǎn)生藥效的有效成分進行確認，以闡明復方貞術調脂方的部分降血脂有效成分和作用機制，本課題的預期完成將為開發(fā)降脂新藥奠定基礎。 方法：（1）利用基因芯片技術觀察復方貞術調脂方用

4、藥前后高脂血癥模型大鼠肝組織基因表達譜的變化，找出差異表達基因并分析其可能的作用靶點；（2）采用RT-PCR，檢測目標基因的表達水平，從目標基因表達水平明確復方貞術調脂方對靶點的影響；（3）利用（酶）、受體功能研究方法，利用試劑盒等手段研究復方貞術調脂方對靶點活性的影響；（4）利用經(jīng)典的受體-配體結合實驗，篩選復方貞術調脂方中有效成分，以完成復方貞術調脂方的部分降血脂有效成分和作用機制。 結果： （1）復方貞術調脂方對高

5、脂血癥模型大鼠肝臟基因表達譜的影響。研究結果顯示，給予高脂血癥模型大鼠FTZ后，可使其基因表達譜出現(xiàn)明顯變化，上調表達的基因有128個，其中差異最顯著的3條基因分別為：NM.130741、NM.199208、NM.013105；下調表達的基因有120個，其中差異最顯著的3條基因分別為：NM.001009663，NM.017136，NM.012941，其中下調基因表達中對HMG-COA還原酶也具有抑制作用（占下調表達基因的第13位）?？紤]

6、到臨床上目前主要降脂藥物為他汀類藥物以及復方貞術調脂方對HMG-COA還原酶的抑制作用，我們選擇HMG-COA還原酶作為機制和藥效成分研究的靶點。 另外，也同時值得關注的是NM.017136基因，該基因編碼角鯊烯環(huán)氧酶，占下調表達基因的第二位，角鯊烯環(huán)氧酶是體內膽固醇合成途徑中的另一個具有重要作用的酶，提示對角鯊烯環(huán)氧酶的調節(jié)可能是FTZ調節(jié)膽固醇代謝的又一靶點之一，進一步的研究角鯊烯環(huán)氧酶在脂代謝中的作用，也可能開發(fā)出降脂新藥

7、。 （2）復方貞術調脂方對高脂血癥模型大鼠肝臟HMG-CoA還原酶mRNA表達的影響。HMG-CoA還原酶是機體內源性膽固醇合成的關鍵限速酶，因此抑制其基因表達可減少體內膽固醇的合成，從而有效的調節(jié)膽固醇的代謝。研究結果顯示，F(xiàn)TZ可顯著抑制高脂血癥模型大鼠肝臟HMG-CoA還原酶mRNA的表達，且有劑量依賴性，在動物實驗中，中劑量組（3.2g/kg）即可抑制酶表達，表明FTZ可對機體內源性膽固醇合成進行有效調節(jié)。 （3

8、）復方貞術調脂方對HMG-CoA還原酶活性的影響。研究結果顯示，F(xiàn)TZ中藥液濃度為1.5、3.0、6.0、12、24 μg/ml時，能呈劑量依賴性地抑制HMG-CoA還原酶的活性，其中結果表明，對HMG-CoA還原酶活性的調節(jié)是復方貞術調脂方發(fā)揮綜合調脂療效的途徑之一。 （4）復方貞術調脂方基于HMG-CoA還原酶靶點的藥效物質成分研究。利用受體-配體結合原理和分子印記技術，我們以臨床上常用的降脂藥物普伐他汀為陽性模型藥，采用高

9、濃度的普伐他?。?00-1000倍），將實驗分組為：1）復方貞術調脂方+HMG-CoA還原酶組；2）復方貞術調脂方+HMG-CoA還原酶+普伐他汀組；3）甲醇+HMG-CoA還原酶組；三組同時孵育、水浴振蕩1小時。利用GF/B玻璃纖維濾膜過濾，Tris-HCl洗滌，最后將濾膜（含HMG-CoA還原酶和FTZ中成分）用無水甲醇抽提，超速離心，去除蛋白質，3個處理組同時進行HPLC分析、分離條件的探索，最后將差異表達峰通過MS進行分析，制備

10、HPLC制備差異成分，表征、鑒定該成分。 結論： （1）利用基因芯片技術成功地鑒定出復方貞術調脂方對高脂血癥模型大鼠肝臟基因表達譜的變化，確定了128個上調表達的基因和120個下調表達的基因。其中HGM-COA還原酶和角鯊烯環(huán)氧酶具有較高的研究價值。 （2）在基因表達水平上，利用RT-PCR技術驗證了復方貞術調脂方對HMG-CoA還原酶mRNA的下調表達。 （3）利用酶促反應確認復方貞術調脂方對HMG-C