復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方基于HMG-CoA還原酶的降脂作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、中藥復(fù)方是中醫(yī)治療疾病時整體觀的具體體現(xiàn)，是在辨證審因決定治法之后，選擇合適的藥物，酌定用量，按照“君、臣、佐、使”，“七情相合”的關(guān)系配伍而成；其作用機(jī)制是通過復(fù)方中各效應(yīng)成分對機(jī)體的多個環(huán)節(jié)予與調(diào)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到整體治療疾病的目的。中藥復(fù)方的核心問題是藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制和配伍規(guī)律，這既受到學(xué)術(shù)界公認(rèn)，亦是中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。 復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方(FTZ)是導(dǎo)師郭姣教授多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾益腎、化痰祛瘀、

2、涼血解毒的功效，并獲得專利授權(quán)。前期研究表明，該方具有降低血TC、TG、LDL-C和升高HDL-C等作用，且能夠上調(diào)脂代謝過程中的兩個關(guān)鍵酶—HMG-COA還原酶、ACO mRNA的表達(dá)水平，調(diào)脂作用優(yōu)于脂必妥，與血脂康、非諾貝特作用相似，且無不良反應(yīng)。在此工作基礎(chǔ)上，本課題擬對復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方的降脂作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)做進(jìn)一步的研究。 目的：高脂血癥是一個復(fù)雜、多因素的多靶點(diǎn)疾病，與遺傳和飲食環(huán)境等因素都有密切的關(guān)系。本課題采

3、用基因芯片技術(shù)先研究復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對高脂血癥大鼠基因表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)影響脂代謝的關(guān)鍵基因，再對該基因的表達(dá)、活性和功能進(jìn)行研究；其次，將對該靶點(diǎn)作用的有效成分采用分子競爭抑制實(shí)驗(yàn)（受體-配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)），結(jié)合現(xiàn)代分離、純化及分析技術(shù)對復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方中通過該靶點(diǎn)產(chǎn)生藥效的有效成分進(jìn)行確認(rèn)，以闡明復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方的部分降血脂有效成分和作用機(jī)制，本課題的預(yù)期完成將為開發(fā)降脂新藥奠定基礎(chǔ)。 方法：（1）利用基因芯片技術(shù)觀察復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方用

4、藥前后高脂血癥模型大鼠肝組織基因表達(dá)譜的變化，找出差異表達(dá)基因并分析其可能的作用靶點(diǎn)；（2）采用RT-PCR，檢測目標(biāo)基因的表達(dá)水平，從目標(biāo)基因表達(dá)水平明確復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對靶點(diǎn)的影響；（3）利用（酶）、受體功能研究方法，利用試劑盒等手段研究復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對靶點(diǎn)活性的影響；（4）利用經(jīng)典的受體-配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，篩選復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方中有效成分，以完成復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方的部分降血脂有效成分和作用機(jī)制。 結(jié)果： （1）復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對高

5、脂血癥模型大鼠肝臟基因表達(dá)譜的影響。研究結(jié)果顯示，給予高脂血癥模型大鼠FTZ后，可使其基因表達(dá)譜出現(xiàn)明顯變化，上調(diào)表達(dá)的基因有128個，其中差異最顯著的3條基因分別為：NM.130741、NM.199208、NM.013105；下調(diào)表達(dá)的基因有120個，其中差異最顯著的3條基因分別為：NM.001009663，NM.017136，NM.012941，其中下調(diào)基因表達(dá)中對HMG-COA還原酶也具有抑制作用（占下調(diào)表達(dá)基因的第13位）?？紤]

6、到臨床上目前主要降脂藥物為他汀類藥物以及復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對HMG-COA還原酶的抑制作用，我們選擇HMG-COA還原酶作為機(jī)制和藥效成分研究的靶點(diǎn)。 另外，也同時值得關(guān)注的是NM.017136基因，該基因編碼角鯊烯環(huán)氧酶，占下調(diào)表達(dá)基因的第二位，角鯊烯環(huán)氧酶是體內(nèi)膽固醇合成途徑中的另一個具有重要作用的酶，提示對角鯊烯環(huán)氧酶的調(diào)節(jié)可能是FTZ調(diào)節(jié)膽固醇代謝的又一靶點(diǎn)之一，進(jìn)一步的研究角鯊烯環(huán)氧酶在脂代謝中的作用，也可能開發(fā)出降脂新藥

7、。 （2）復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對高脂血癥模型大鼠肝臟HMG-CoA還原酶mRNA表達(dá)的影響。HMG-CoA還原酶是機(jī)體內(nèi)源性膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶，因此抑制其基因表達(dá)可減少體內(nèi)膽固醇的合成，從而有效的調(diào)節(jié)膽固醇的代謝。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ可顯著抑制高脂血癥模型大鼠肝臟HMG-CoA還原酶mRNA的表達(dá)，且有劑量依賴性，在動物實(shí)驗(yàn)中，中劑量組（3.2g/kg）即可抑制酶表達(dá)，表明FTZ可對機(jī)體內(nèi)源性膽固醇合成進(jìn)行有效調(diào)節(jié)。 （3

8、）復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對HMG-CoA還原酶活性的影響。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ中藥液濃度為1.5、3.0、6.0、12、24 μg/ml時，能呈劑量依賴性地抑制HMG-CoA還原酶的活性，其中結(jié)果表明，對HMG-CoA還原酶活性的調(diào)節(jié)是復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方發(fā)揮綜合調(diào)脂療效的途徑之一。 （4）復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方基于HMG-CoA還原酶靶點(diǎn)的藥效物質(zhì)成分研究。利用受體-配體結(jié)合原理和分子印記技術(shù)，我們以臨床上常用的降脂藥物普伐他汀為陽性模型藥，采用高

9、濃度的普伐他?。?00-1000倍），將實(shí)驗(yàn)分組為：1）復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方+HMG-CoA還原酶組；2）復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方+HMG-CoA還原酶+普伐他汀組；3）甲醇+HMG-CoA還原酶組；三組同時孵育、水浴振蕩1小時。利用GF/B玻璃纖維濾膜過濾，Tris-HCl洗滌，最后將濾膜（含HMG-CoA還原酶和FTZ中成分）用無水甲醇抽提，超速離心，去除蛋白質(zhì)，3個處理組同時進(jìn)行HPLC分析、分離條件的探索，最后將差異表達(dá)峰通過MS進(jìn)行分析，制備

10、HPLC制備差異成分，表征、鑒定該成分。 結(jié)論： （1）利用基因芯片技術(shù)成功地鑒定出復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對高脂血癥模型大鼠肝臟基因表達(dá)譜的變化，確定了128個上調(diào)表達(dá)的基因和120個下調(diào)表達(dá)的基因。其中HGM-COA還原酶和角鯊烯環(huán)氧酶具有較高的研究價值。 （2）在基因表達(dá)水平上，利用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對HMG-CoA還原酶mRNA的下調(diào)表達(dá)。 （3）利用酶促反應(yīng)確認(rèn)復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂方對HMG-C