他汀類藥物對胰島β細胞功能的影響和作用機制探討以及新型HMg-CoA還原酶抑制劑的發(fā)現(xiàn).pdf

1、他汀類藥物對胰島β細胞功能的影響和作用機制探討以及新型HMG-CoA還原酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)
　　 糖尿病并發(fā)癥是嚴重威脅2型糖尿病患者生命的危險因素之一，且2型糖尿病患者常伴有高膽固醇血癥。而心血管壁內(nèi)膽固醇等脂質(zhì)的沉著和堆積，導致2型糖尿病患者冠心病、心肌梗塞等心血管病的發(fā)生率顯著增加。因此，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂是治療2型糖尿病的重要方案之一。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)是體內(nèi)膽固醇合成的

2、限速酶，他汀類藥物屬于HMG-CoA還原酶抑制劑，可以與底物結(jié)合并競爭性地抑制該酶活性，從而減少膽固醇的合成。目前，他汀類已成為糖尿病心血管并發(fā)癥一、二級預(yù)防的關(guān)鍵治療藥物。2001年報道的WOSCOPS臨床試驗顯示，普伐他汀可使糖尿病的發(fā)生率較安慰劑組降低30％，研究者推測這可能與其能夠顯著降低血甘油三酯有關(guān)。目前，應(yīng)用于臨床的他汀類藥物主要包括天然化合物和全合成化合物，天然化合物包括洛伐他丁、辛伐他汀和普伐他汀等，全合成化合物包括氟

3、伐他汀、阿托伐他汀、匹伐他汀和瑞舒伐他汀等。其中，普伐他汀和瑞舒伐他汀為水溶性，其它5個品種屬于脂溶性。據(jù)報道，他汀類的溶解性能夠影響其代謝途徑和藥理活性。因此，本文選擇了阿托伐他汀(Ator)和普伐他汀(Prav)兩種不同溶解性的他汀類藥物作為研究對象。近年來，許多研究也發(fā)現(xiàn)他汀類藥物降脂作用外的多種藥理效應(yīng)，包括對機體胰島素抵抗和葡萄糖代謝的改善，但對胰島β細胞功能是否有直接的改善作用尚未見報道。因此，本論文旨在：1）探討他汀類藥物

4、對胰島β細胞的作用及其機制；2）建立月旨毒性誘導的胰島β細胞凋亡模型，并考察他汀類藥物的對β細胞凋亡的保護作用；3)建立并優(yōu)化體外HMG-CoA還原酶抑制劑的篩選方法，對一定量的化合物進行活性評價，為尋找和發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)的HMG-CoA還原酶抑制劑奠定實驗基礎(chǔ)和提供技術(shù)平臺。
　　 (1)他汀類藥物對2型糖尿病實驗動物模型胰島β細胞功能的影響及其機制研究：
　　 采用高脂誘導的肥胖C57BL/6J小鼠和自發(fā)性2型糖尿病KKA

5、y小鼠兩種模型動物，以二甲雙胍作為陽性對照藥，考察阿托伐他?。ˋtor，劑量30mg/kg）和普伐他?。≒rav，劑量30mg/kg）對上述2種模型動物的糖、脂代謝紊亂及胰島β細胞功能的改善作用。
　　 在C57BL/6J小鼠模型中，Ator和Prav可顯著降低模型動物體重，其中Ator能夠在一定程度上改善C57BL/6J小鼠的胰島素敏感性。在高血糖鉗夾實驗中，Ator和Prav都可顯著增加穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注速率(GIR)，提示At

6、or和Prav能夠顯著改善胰島β細胞的胰島素分泌功能?；蛩奖磉_變化結(jié)果顯示，Ator和Prav可顯著上調(diào)C57BL/6J小鼠胰腺中PDX-1和LXR-β的基因表達水平，可能對胰島β細胞中的胰島素合成及脂質(zhì)代謝環(huán)節(jié)具有一定的改善作用。Western blot結(jié)果顯示，Ator和Prav均能夠顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4和Chop的表達，且增加胰腺增殖相關(guān)的PDX-1蛋白表達，其中Ator還能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中磷酸化eIF2α

7、蛋白的表達。
　　 在KKAy小鼠模型中，兩種他汀類藥物均能顯著降低模型動物的血甘油三酯、膽固醇和血胰島素水平。其中，Ator能夠顯著改善KKAy小鼠的葡萄糖耐量異常，Prav能夠顯著降低KKAy小鼠胰島素耐量實驗中的40 min血糖及AUC，改善其胰島素敏感性，Prav還可顯著降低血漿中過氧脂質(zhì)化物——丙二醛(MDA)的含量。表明Ator和Prav具有顯著調(diào)節(jié)KKAy小鼠糖、脂代謝紊亂，改善胰島素敏感性及氧化應(yīng)激狀態(tài)等作用，采

8、用實時定量PCR技術(shù)考察兩種藥物對胰腺組織中脂質(zhì)及能量代謝相關(guān)基因變化的影響。結(jié)果顯示：Ator可顯著上調(diào)胰腺組織中AMPK、Bc1-2、LXR-β等基因的表達，并且Ator和Prav均能顯著上調(diào)SREBP-2的表達，提示兩種他汀類藥物可能通過調(diào)節(jié)胰腺中能量及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，降低模型動物的胰腺脂毒性，并通過上調(diào)抗凋亡基因的表達，對胰島細胞凋亡具有一定保護作用。Western blot結(jié)果顯示，兩種他汀類藥物均能顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵

9、蛋白Chop的表達，提示兩種他汀類藥物可能通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，緩解胰島β細胞內(nèi)的代謝壓力，從而對糖、脂代謝壓力導致的胰島素分泌功能紊亂及細胞凋亡具有一定的緩解和保護作用。
　　 以上結(jié)果提示，Ator對胰島β細胞功能的改善作用可能是通過作用于eIF2α-ATF4-Chop通路而緩解了細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；Prav對胰腺β細胞功能的影響也可能是通過影響該通路中的部分因子而實現(xiàn)的。
　　 (2)膽固醇誘導的胰島β細胞凋亡模型的建立

10、以及阿托伐他汀對β細胞凋亡的保護作用
　　 膽固醇在胰島β細胞膜上的沉著和堆積將導致其分泌功能的紊亂及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本部分的研究以小鼠胰島細胞瘤細胞株NIT-1細胞為研究對象，模擬體內(nèi)高膽固醇環(huán)境，建立胰島β細胞的凋亡模型。結(jié)果顯示，用終濃度為0.125 mM的水溶性膽固醇與NIT-1細胞共同孵育18h后，細胞的活力顯著降低并發(fā)生凋亡，形成適宜于試驗的細胞凋亡模型。Ator可劑量依賴性地增加高膽固醇脂毒性誘導NIT-1細胞損傷后的

11、細胞活力，并且流式細胞檢測結(jié)果顯示，Ator在10-8M濃度下可以顯著降低細胞的凋亡發(fā)生率。Western blot結(jié)果顯示，Ator干預(yù)能夠明顯降低凋亡模型NIT-1細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白磷酸化eIF2α水平，提示Ator可顯著改善高膽固醇誘導的胰島β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 (3) HMG-CoA還原酶抑制劑篩選方法的優(yōu)化和活性化合物的篩選
　　 根據(jù)體內(nèi)膽固醇合成的限速反應(yīng)方程式：(S)-HMG-CoA+2NADPH+

12、2H→(R)-甲羥戊+CoA+2NADP+，HMG-CoA還原酶可以利用NADPH所攜帶的2個H原子將底物S)-HMG-CoA還原為(R)-甲羥戊酸。本研究在已有篩選方法的基礎(chǔ)上，對實驗步驟和所用試劑進行了優(yōu)化，使反應(yīng)體系更加完善，結(jié)果重現(xiàn)性較好。Ator作為陽性對照藥的適宜篩選濃度為10-7M。對150多個化合物進行了篩選，發(fā)現(xiàn)其中有數(shù)個化合物對HMG-CoA還原酶有抑制作用，且IC50為10-5-10-6 M，但與Ator相比，活性