HMG-CoA還原酶抑制劑對INS-1細(xì)胞Ras-Raf-ERK-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的:胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能受損是2型糖尿病發(fā)病的兩個(gè)最重要的病理生理機(jī)制。如何最大限度地保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，避免糖尿病患者因使用其它藥物而導(dǎo)致本已受損的β細(xì)胞功能進(jìn)一步惡化，一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。目前已經(jīng)證實(shí)，多種臨床藥物均可影響胰島β細(xì)胞功能，影響胰島素分泌，進(jìn)而影響糖代謝。
　　阿托伐他汀作為HMG-CoA還原酶抑制劑，以其明確的調(diào)脂療效和較好的耐受性而廣泛應(yīng)用于糖尿病患者，且時(shí)間窗越來越早、應(yīng)用時(shí)間越來越長

2、、劑量越來越大。該類藥物的調(diào)脂外作用也日益受到關(guān)注，其中包括對糖尿病的影響。近來多項(xiàng)臨床薈萃分析發(fā)現(xiàn)他汀類藥物使糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)增加，且呈藥物劑量依賴性，但具體機(jī)制尚不清楚。體內(nèi)外研究證實(shí)，HMG-CoA還原酶抑制劑除具有良好的降低膽固醇水平作用外，還可通過抑制胰島β細(xì)胞ATP敏感K+通道和電壓依從性鈣通道活性而抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌，通過抑制胰島素啟動(dòng)子活性而抑制胰島素mRNA表達(dá)。但HMG-CoA還原酶抑制劑通過何種具體機(jī)制抑制

3、胰島素啟動(dòng)子活性進(jìn)而抑制胰島素合成目前尚未見相關(guān)研究報(bào)道。
　　HMG-CoA還原酶抑制劑通過抑制甲羥戊酸代謝產(chǎn)物如焦磷酸法呢酯(FPP)、焦磷酸龍牛兒基龍牛兒醇(GGPP)的合成，使依賴FPP、GGPP修飾的小GTP蛋白如Ras和Rho不能定位于細(xì)胞膜，從而抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。Ras/Raf/ERK/CREB信號(hào)通路是目前比較明確的胰島素信號(hào)通路，主要參與胰島素的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。由此，HMG-CoA還原酶抑制劑與Ras/Raf/E

4、RK/CREB信號(hào)通路的關(guān)系值得深入探討。本研究觀察高糖刺激下阿托伐他汀干預(yù)后胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞Ras/Raf/ERK/CREB信號(hào)通路中各個(gè)關(guān)鍵激酶活性的變化以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子CREB/DNA結(jié)合活性，以明確阿托伐他汀對Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子水平變化的影響，探討他汀類藥物抑制胰島β細(xì)胞胰島素啟動(dòng)子活性，進(jìn)而抑制胰島素mRNA表達(dá)的作用機(jī)制。
　　方法:以胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞為模型，體外觀察阿托伐他汀對INS-1細(xì)胞

5、Ras復(fù)合體途徑中(Ras/Raf/ERK/CREB)的影響。本實(shí)驗(yàn)分別采用Westernblot、RT-PCR方法檢測阿托伐他汀對胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Ras復(fù)合體途徑中各關(guān)鍵酶(RasGTPase、p-Raf-1、p-CERB)活性變化。采用染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測阿托伐他汀對INS-1細(xì)胞p-CREB/DNA結(jié)合活性的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)高糖(25mmol/L)誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞Ras通路蛋白活性增加，且呈時(shí)間

6、依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高糖組磷酸化Raf-1激酶表達(dá)水平與正常組比較明顯增高，隨著時(shí)間的延長，磷酸化水平逐漸增加，2小時(shí)表達(dá)開始增高，6小時(shí)增高明顯，達(dá)對照組的2.4倍，而對Raf-1的蛋白總量影響不大。
　　(2)阿托伐他汀呈濃度依賴性抑制INS-1細(xì)胞Ras通路中關(guān)鍵因子蛋白p-Raf-1的活性。不同濃度阿托伐他汀處理細(xì)胞24h后，隨著阿托伐他汀濃度增加，磷酸化Raf-1表現(xiàn)為明顯抑制，表達(dá)量逐漸減少。與對照組相比，p-Raf-

7、1表達(dá)水平在1μmol/L及10μmol/L時(shí)下降不明顯(P>0.05)，在50μmol/L時(shí)出現(xiàn)明顯降低(P<0.01)，在100μmol/L時(shí)阿托伐他汀組中出現(xiàn)較強(qiáng)的抑制(P<0.01)。
　　(3)50μmol/L阿托伐他汀抑制INS-1細(xì)胞Ras通路中關(guān)鍵因子蛋白的活性。INS-1細(xì)胞經(jīng)高糖(25mmol/L)刺激6小時(shí)后加用50μmol/L阿托伐他汀處理，經(jīng)Westernbloting檢測顯示，與高糖組相比，阿托伐他汀組

8、RasGTPase、p-Raf-1、p-CREB的蛋白表達(dá)水平均明顯下降，抑制率分別為61.8％、60.9％、55.4％(P<0.01)。
　　(4)本實(shí)驗(yàn)在基因水平檢測發(fā)現(xiàn)各關(guān)鍵酶表達(dá)沒有變化，高糖組RasmRNA表達(dá)與對照組相比變化不明顯，與同濃度葡萄糖組相比，阿托伐他汀組、RasGTPase抑制劑ManumycinA組RasmRNA表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。
　　(5)阿托伐他汀抑制INS-1細(xì)胞p-CREB/D

9、NA結(jié)合活性。與對照組相比，高糖刺激后INS-1細(xì)胞p-CREB/DNA結(jié)合量明顯增高。與高糖組相比，阿托伐他汀藥物處理組及ManumycinA組p-CREB/DNA結(jié)合量均明顯下降(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)體外高糖能明顯誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞株INS-1細(xì)胞Ras/Raf/ERK/CREB信號(hào)通路中關(guān)鍵酶活性增加，且呈時(shí)間依賴性。
　　(2)阿托伐他汀濃度依賴性抑制胰島β細(xì)胞株Ras/Raf/ERK/CREB

10、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路RasGTPase的活性，抑制通路的激活。進(jìn)一步抑制其下游分子p-Raf-1、p-CERB蛋白表達(dá)，降低INS-1細(xì)胞p-CREB與DNA的結(jié)合量。
　　(3)阿托伐他汀通過抑制胰島β細(xì)胞中Ras蛋白的翻譯后修飾，抑制RasGTPase活性，進(jìn)而抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的Ras復(fù)合體途徑(Ras/Raf/ERK/CREB)中各關(guān)鍵酶活性，導(dǎo)致p-CREB/DNA結(jié)合量降低而抑制胰島素啟動(dòng)子活性，抑制胰島素合成。提示他汀