miR-18a通過調(diào)控RUNX1基因表達(dá)影響血腫瘤屏障功能的機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　惡性腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，主要治療方法是手術(shù)與放化療。化療已成為惡性腦膠質(zhì)瘤的重要治療手段之一，而血腫瘤屏障的存在是限制大分子化療藥物進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮化療療效的關(guān)鍵。
　　Mirco RNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要調(diào)節(jié)作用，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。每個(gè)miRNA都有多個(gè)靶基因，多個(gè)miRNA也可同時(shí)調(diào)節(jié)一個(gè)靶基因，從而參與生命過程

2、中的一系列重要進(jìn)程，例如早期發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡、死亡等。近期有研究報(bào)道，miR-18家族成員(miR-17,miR-18a，miR-19a/b，miR-20a和miR-92a)參與細(xì)胞周期、分化、凋亡等調(diào)控，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-18a屬于miR17～92多順反子家族成員，目前對(duì)miR-17、miR-20和miR-92a的報(bào)道較多，而對(duì)miR-18a的報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)

3、胞凋亡等作用[25]-[26]。在參與調(diào)節(jié)血管生成方面的研究中，發(fā)現(xiàn)部分miR-17-92家族成員在利用體外正常內(nèi)皮細(xì)胞血管生成模型以及缺血或梗死的動(dòng)物模型的研究中顯示出抑制血管生成的作用[11][14]。過表達(dá)miR-18a能夠抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和結(jié)腸癌組織中的血管生成，過表達(dá)miR-18a可能成為結(jié)腸癌治療的新方法[27]。但是有關(guān)miR-18a表達(dá)與血腦屏障通透性改變之間的關(guān)系及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族

4、有3個(gè)成員，RUNX1，RUNX2和RUNX3。三者在人體發(fā)育過程中顯示出各自獨(dú)特的功能，如RUNX1基因是人類白血病中多個(gè)染色體易位的常見靶位點(diǎn)，它的突變可引起急性髓細(xì)胞性白血病;RUNX2是骨生成過程中的必需;RUNX3基因突變可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)。近期對(duì)RUNX轉(zhuǎn)錄因子家族的研究顯示，RUNX基因?qū)Σ煌谢蛴屑せ罨蛞种妻D(zhuǎn)錄的作用，其異?？烧T發(fā)腫瘤[3]。RUNX1基因，亦稱作急性髓性白血病1(AML-1)，位于人類染色體21q2

5、2.3，由12個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)大于260kb[24]。它在正常造血、惡性造血、細(xì)胞分化等過程中均發(fā)揮重要作用。大量造血相關(guān)基因作為RUNX1的靶基因，RUNX1與相關(guān)靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合后，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究表明，RUNX1還具有調(diào)控T細(xì)胞的功能，從而與自身免疫病相關(guān)[4]。在對(duì)RUNX1的靶基因的研究中發(fā)現(xiàn)，RUNX1作為轉(zhuǎn)錄激活因子可招募其它轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物。RUNX1不僅在血液系統(tǒng)中有十分重要的轉(zhuǎn)錄激活作用，同時(shí)在

6、其他系統(tǒng)中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX1可與前列腺素相結(jié)合，參與排卵的調(diào)控。研究還發(fā)現(xiàn)，RUNX1可上調(diào)靶基因lagals3，參與人類垂體瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。但是RUNX1是否參與miR-18a調(diào)控血腫瘤屏障通透性，尚未見報(bào)道。
　　本研究中，應(yīng)用過表達(dá)miR-18a質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hCMEC/D3細(xì)胞，建立體外BTB模型;研究miR-18a過表達(dá)對(duì)BTB通透性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-18a是否能通過調(diào)節(jié)RUNX1影響血

7、腫瘤屏障的通透性，并初步明確其可能的分子機(jī)制，為腦膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新途徑。
　　方法：
　　1、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3細(xì)胞，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　2、miR-18a過表達(dá)或表達(dá)沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立。
　　3、體外BTB模型的建立。
　　4、RUNX1過表達(dá)質(zhì)粒和表達(dá)沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和miR-18a過表

8、達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　5、應(yīng)用real-time PCR和western blot檢測(cè)miR-18a和RUNX1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)水平。
　　6、應(yīng)用跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electric resistance，TEER)和辣根過氧化物酶horseradish peroxidase，HRP）滲出量評(píng)估體外BTB模型的通透性變化。
　　7、應(yīng)用real-time PCR、West

9、eern blot和免疫熒光法檢測(cè)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中RUNX1、緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA以及蛋白表達(dá)水平變化和分布。
　　8、應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-18a和RUNX1的直接作用。
　　9、應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀分析RUNX1與緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的直接作用。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立過表達(dá)miR-18a的穩(wěn)

10、定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　2、成功建立體外BTB模型，獲得膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3、miR-18a在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著降低。
　　4、RUNX1在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著升高。
　　5、過表達(dá)miR-18a顯著增加BTB的通透性。
　　6、過表達(dá)miR-18a顯著下調(diào)RUNX1和緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的

11、表達(dá)，并改變其分布。
　　7、RUNX1是miR-18a的靶基因。
　　8、過表達(dá)miR-18a顯著下調(diào)RUNX1的表達(dá)，并改變其分布。
　　9、miR-18a和RUNX1反向共同調(diào)節(jié)BTB的通透性。
　　10、miR-18a和RUNX1反向共同調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)水平。
　　11、膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中RUNX1與緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludi

12、n和claudin-5的啟動(dòng)子直接結(jié)合。
　　討論：
　　本研究證明，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平顯著低于在正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。許多研究表明miR-18a參與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大多數(shù)報(bào)道表明，miR-18a在結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌等癌癥中表達(dá)上調(diào)，因此miR-18a被認(rèn)為是候選的促癌基因。然而，L.Venturini等人發(fā)現(xiàn)miR-17-92家族的其他成員在慢病毒轉(zhuǎn)化K562

13、克隆細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-18a的表達(dá)卻并未改變，這一原因還未被澄清。Fox等人發(fā)現(xiàn)miR-18a在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)很少，這與我們的研究結(jié)果一致。miR-18a在不同腫瘤細(xì)胞以及不同組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)水平，在不同的微環(huán)境下，miR-18a在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能起不同的作用。然而，miR-18a是否參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能并進(jìn)一步調(diào)節(jié)BTB通透性仍不清楚。
　　為探討miR-18a對(duì)BTB通透性的影響，本研究

14、建立了過表達(dá)miR-18a的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，成功建立了體外BTB模型。分別應(yīng)用TEER和HRP滲出量檢測(cè)BTB的完整性和通透性。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-18a破壞BTB的完整性，使它的通透性增加。緊密連接蛋白在血腦屏障的形成和維持中發(fā)揮重要作用。ZO-1、occludin、claudin-5都是緊密連接的重要組成部分。在本研究中real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示miR-18a過表達(dá)顯著下調(diào)ZO-1、occlu

15、din、claudin-5的mRNA和蛋白表達(dá);熒光染色的結(jié)果與real-time PCR、Western blot檢測(cè)結(jié)果相一致。目前，我們已經(jīng)證明了miR-18a通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)改變BTB的通透性。
　　然而，miR-18a調(diào)節(jié)BTB通透性的可能分子機(jī)制仍不清楚。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，RUNX1被認(rèn)為是一些miRNA的可能的下游靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，miR-23a的過表達(dá)可誘導(dǎo)惡性淋

16、巴瘤中RUNX1表達(dá)下調(diào)，在胃癌組織中，miR-23a與RUNX1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。我們應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測(cè)到在RUNX1 mRNA的3'UTR有一個(gè)潛在的miR-18a結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示RUNX1是miR-18a的靶基因。同時(shí)，miR-18a過表達(dá)能夠顯著下調(diào)RUNX1的mRNA和蛋白表達(dá)。其他研究者的研究結(jié)果也支持我們的觀點(diǎn)。比如，在胃癌和淋巴癌中，miR-18a的表達(dá)上調(diào)，而RUNX1

17、的表達(dá)下調(diào)。為了更好地研究miR-18a與RUNX1對(duì)BTB通透性的作用關(guān)系，我們?cè)趆CMEC/D3細(xì)胞和過表達(dá)miR-18a的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中分別過表達(dá)或表達(dá)沉默RUNX1，然后建立體外BTB模型。結(jié)果顯示，miR-18a和RUNX1反向共同調(diào)節(jié)BTB的通透性和緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)。這進(jìn)一步說明了過表達(dá)miR-18a能夠通過下調(diào)RUNX1，降低緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和cl

18、audin-5的表達(dá)，進(jìn)而增加BTB的通透性。進(jìn)一步的染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明，在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，RUNX1可以與ZO-1、occludin和claudin-5啟動(dòng)子區(qū)一個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)(TGGGGT)相結(jié)合。我們知道，轉(zhuǎn)錄因子不但通過控制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物同時(shí)可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子本身。最近的一項(xiàng)研究顯示，RUNX1與它的突變體在與ETS-1，CBFβ或者FLI-1結(jié)合上協(xié)同激活PF4啟動(dòng)子。有報(bào)道說明，RUNX1通過結(jié)合促血小板生成素

19、(TPO) recaptor/c-Mp1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的生成，隨后轉(zhuǎn)錄激活物或抑制物的聚集從而促進(jìn)生血內(nèi)皮細(xì)胞向造血干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。RUNX1同樣可調(diào)節(jié)自身表達(dá)水平通過上調(diào)Smad6的表達(dá)使自己被蛋白酶降解。然而，RUNX1與緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的直接結(jié)合能否調(diào)節(jié)RUNX1的轉(zhuǎn)錄活性還需進(jìn)一步探索。
　　本研究證明了miR-18a可能是BTB通透性的重要調(diào)節(jié)因子。過表達(dá)miR-18a通過

20、下調(diào)RUNX1，降低緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)，進(jìn)而增加BTB的通透性。由此我們認(rèn)為miR-18a和RUNX1可作為抗腫瘤藥物通過BTB的潛在靶點(diǎn)，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略。
　　結(jié)論：
　　1、miR-18a和RUNX1在正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)源性表達(dá)趨勢(shì)相反，miR-18a在膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯降低，而RUNX1則明顯