轉錄因子RUNX1調控腎臟炎癥及纖維化研究.pdf

1、背景與目的：慢性腎臟病常伴隨炎癥和纖維化病變，而炎癥貫穿于腎纖維化全過程。腎小管上皮細胞及其間充質轉分化（EMT）以及巨噬細胞是腎臟炎癥和纖維化形成的重要機制。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞可通過轉分化形式表達天然免疫分子DC-SIGN，參與腎小管間質炎癥和纖維化形成。進一步發(fā)現(xiàn)巨噬細胞可通過表達DC-SIGN并與TLR4相互作用，參與腎臟局部炎癥調節(jié)。轉錄因子RUNX1是造血干細胞分化的重要調節(jié)因子。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RUNX1可能參

2、與TGF-β誘導的EMT調控，基于炎癥與纖維化的緊密關系，推測其可能也參與腎臟炎癥和纖維化形成。為此本研究在前期工作基礎上，擬從腎臟炎癥和纖維化兩個層面并以上述細胞為研究對象，探討RUNX1對巨噬細胞和腎小管上皮細胞參與腎臟炎癥和纖維化病變中的調控作用，以及可能涉及的分子機制。
　　方法：（1）利用人單核巨噬細胞系THP-1、小鼠巨噬細胞系RAW264.7以及小鼠原代腹腔巨噬細胞（PEM），分別給予LPS（100 ng/mL或10

3、00 ng/mL）刺激，采用RT-qPCR及Western blot檢測RUNX1的mRNA及蛋白表達水平；繼而利用siRNA技術干擾RUNX1的表達，PEM細胞經LPS刺激并采用RT-qPCR和ELISA，檢測炎癥因子 IL-1β、IL-6及 TNF-α的分泌變化；隨后利用 RAW264.7細胞構建過表達RUNX1穩(wěn)轉株，經LPS刺激并采用RT-qPCR及ELISA，檢測炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的分泌變化；進一步利用R

4、UNX1抑制劑（Ro5-3335）干預，采用RT-qPCR和ELISA檢測上述炎癥因子分泌變化。（2）利用siRNA技術干擾RUNX1表達，PEM細胞經LPS刺激并采用Western blot，檢測JNK、ERK、p38及p65的磷酸化水平以及IκBα降解狀況；繼而利用RUNX1抑制劑（Ro5-3335）干預，采用雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)，檢測RUNX1及其不同截短體（1-242aa、50-178aa、243-453aa）對p50、p65

5、及p105誘導NF-κB熒光素酶活性的影響；隨后采用免疫共沉淀實驗，分別檢測p50、p65及p105與 RUNX1結合狀況。（3）進一步利用上述RUNX1抑制劑干預，體內觀察對 LPS誘導內毒素休克模型小鼠生存狀況以及炎癥因子 IL-1β、IL-6及TNF-α分泌的影響。（4）利用人腎小管上皮細胞（HK-2）和大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E，分別給予EMT誘導因子TGF-β刺激，采用RT-qPCR及Western blot，檢測上述腎

6、小管上皮細胞RUNX1的mRNA及蛋白表達水平；繼而利用siRNA技術干擾RUNX1表達，HK-2細胞經TGF-β刺激，采用光學顯微鏡觀察EMT中細胞形態(tài)變化；此外利用HK-2細胞構建過表達RUNX1穩(wěn)轉株，結合siRNA干擾技術，采用RT-qPCR檢測EMT標志物Snai2、Vimentin表達；隨后利用上述人和大鼠腎小管上皮細胞構建過表達RUNX1穩(wěn)轉株，采用RT-qPCR及Western blot，檢測上述標志物Snail、Sna

7、i2、Vimentin、α-SMA表達。（5）進一步利用建立單側輸尿管梗阻纖維化小鼠模型（UUO），采用RT-qPCR檢測腎組織中RUNX1、TGF-β、Snail、Snail2、Vimentin、Col1a1、Fibronectin等表達變化。
　　結果：（1）RUNX1可在巨噬細胞中組成性表達，而LPS可下調其表達；上調或下調巨噬細胞RUNX1表達，則可明顯促進或抑制LPS誘導的炎癥因子IL-1β及IL-6分泌。（2）此外發(fā)現(xiàn)

8、 RUNX1不影響 TLR4下游信號通路的JNK、ERK、p38、p65磷酸化水平以及IκBα的降解，但其可明顯增強p50、p65和p105誘導的NF-κB活力，上述效應可被RUNX1抑制劑予以抑制。進一步發(fā)現(xiàn)RUNX1可與p50相互結合。（3）體內實驗進一表明，利用RUNX1抑制劑干預，則可抑制LPS誘導的內毒素性休克模型小鼠腎內炎癥因子IL-6分泌，減輕小鼠腎臟炎癥并改善其生存狀況。（4）另一方面，RUNX1可在促纖維化因子TGF-

9、β誘導的腎小管上皮細胞中明顯表達；上調或下調RUNX1表達，則可顯著促進或抑制TGF-β誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞形態(tài)轉變以及EMT標志物Snai2及Vimentin的表達。（5）體內實驗進一步表明，伴隨 RUNX1在纖維化小鼠模型腎組織中明顯表達，EMT及纖維化指標 Snail、fibronectin、Col1a1、CCL2及TGF-β均顯著上調，且小鼠腎纖維化程度明顯加重。
　　結論：RUNX1可通過調控 NF-κB信號通